Teknologi Pengeluaran Insulin

Analisis

Insulin adalah salah satu hormon yang dihasilkan oleh tubuh manusia sendiri, khususnya pankreas. Pelanggaran sekresi bahan ini membawa kepada kemunculan penyakit yang serius seperti diabetes. Untuk rawatannya menggunakan hormon sintetik, yang lama terpencil dari pankreas ternakan. Walau bagaimanapun, teknologi untuk menghasilkan insulin dengan bantuan bakteria yang sangat biasa - Escherichia coli atau jamur ragi telah digunakan untuk masa yang lama. Menggunakan kaedah ini membolehkan anda mengelakkan tindak balas alergi yang disebabkan oleh protein asing, yang mempunyai sedikit perbezaan dari manusia.

Skim teknologi

Teknologi pengeluaran insulin merangkumi semua peringkat utama pengeluaran produk bioteknologi. Hasilnya adalah produk akhir kristal, yang kemudiannya digunakan untuk menyediakan penyelesaian suntikan yang digunakan dalam rawatan diabetes mellitus yang teruk jenis I dan II. Kesan utama hormon ini dalam tubuh ditunjukkan dalam penurunan tahap glukosa yang terkandung di dalam darah.

Tahap pengeluaran insulin adalah seperti berikut:

Awal. Ia menjalankan operasi seperti penyediaan dan pembersihan air dan udara, pembersihan premis industri dan pensterilan peralatan, pemeriksaan kakitangan, pemprosesan tangan dan pengeluaran kasut steril dan pakaian. Juga pada peringkat awal, sintesis kimia primer rantaian molekul yang mana protein dipasang dipasang. Rantai A mengandungi 21 residu asid amino, dan rantai B mengandungi 30 asid amino.
Penyediaan penyelesaian nutrien dan budaya sel. Untuk membuat sel hidup menghasilkan sebatian yang diperlukan, gen yang sesuai diperkenalkan. Untuk ini, plasmid dipotong oleh enzim-enzim khas, larangan, dan gen yang mengodkan sintesis sebatian yang diperlukan dijahit ke dalamnya. Kemudian, menggunakan kaedah microinjection, plasmid diubah suai dikembalikan ke sel.
Penanaman penangguhan sel. Sel-sel yang diubahsuai secara genetik diletakkan dalam larutan nutrien, mempunyai semua bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan pembiakan dan menjalani pensterilan. Penanaman budaya berlaku di bioreactor khas, di mana udara pra-dimurnikan diberi makan. Secara berkala, sejumlah larutan nutrien ditambah ke reaktor dan pada masa yang sama jumlah penggantian sel yang sama ditarik balik.
Peruntukan budaya. Pemisahan budaya bendalir dan sel dilakukan oleh sedimentasi (sedimentasi) di sedimentator khusus, dan kemudian penyaringan, yang membolehkan untuk memelihara integritas sel-sel.
Pembersihan kromatografi bahan tersebut. Ia dilakukan pada peralatan yang sesuai, menggunakan pelbagai kaedah, terutamanya, kromatografi penyerapan anion-pertukaran dan permeasi gel.
Mendapatkan molekul protein. Pada peringkat biotek yang sebenar, sintesis molekul insulin yang tidak dihasilkan berlaku. Dan kedua komponen rantainya. Mereka dijadikan selepas pengoksidaan dan lipatan rantai yang diperoleh, menyebabkan pembentukan jambatan disulfida.
Pembekuan beku dalam ketuhar khas, selepas itu penyediaan kristal yang terhasil diperiksa untuk pematuhan standard, dibungkus, dilabel dan dihantar kepada pengguna.

Syarikat kami atas terma yang menggembirakan menawarkan barisan pengeluaran siap pakai, di mana semua teknologi pengeluaran insulin sepenuhnya dipatuhi. Terima kasih kepada pengiraan yang tepat, sokongan teknikal dan maklumat, serta latihan kakitangan dalam rangka program komprehensif, syarikat akan menguntungkan dan produknya akan menjadi permintaan.

Penemuan insulin

Hari ini, diabetes menjejaskan lebih daripada 400 juta orang di planet ini, iaitu kira-kira 8% daripada populasi dewasa di dunia. Menurut daftar negara, lebih daripada 3.3 juta orang mengalami diabetes di Rusia (kira-kira 300 ribu orang menderita diabetes jenis 1, dan kira-kira 3 juta orang menderita diabetes jenis 2). Walau bagaimanapun, angka-angka ini tidak mencerminkan keadaan sebenar. Semua orang ini, hidup setiap hari, memahami bahawa hidup mereka bergantung kepada insulin.

Percubaan pertama untuk mengubati diabetes telah dibuat sebelum zaman kita. Pakar-pakar perubatan Yunani kuno dan Rom yang digunakan untuk urut, gimnastik, mandian, aromaterapi dan banyak lagi. Pada abad ke-19, diet daging karbohidrat rendah telah dibangunkan untuk pesakit kencing manis. Percubaan pertama untuk mengubati diabetes dengan suntikan insulin telah dibuat pada tahun 1921. Saintis Kanada Frederick Banting menjadi orang pertama yang menggunakan hormon insulin untuk mengawal diabetes. Dia hanya 32 kod apabila dia menerima Hadiah Nobel dalam bidang perubatan. Dia membuat ubat secara berkesan dan tanpa kesan sampingan mengurangkan tahap glukosa dari 28.9 hingga 6.7 mmol / l. Ubat ini memberikan harapan kepada banyak orang.

Pada tahun 1869, saintis Paul Langergans menemui kumpulan sel dalam pankreas, yang kemudian dinamakan sempena "pulau-pulau Langerhans". Insulin kemudiannya diasingkan dari sel-sel di pulau-pulau kecil ini. Insulin adalah hormon yang mengawal metabolisme, terutamanya karbohidrat (gula), tetapi juga lemak dan protein. Diabetis akibat pendedahan insulin yang tidak mencukupi, gangguan metabolik yang kompleks berlaku, paras gula darah meningkat (hiperglikemia), gula dikeluarkan di dalam air kencing (glycosuria), dan produk berasid yang mengalami pembekuan lemak terjejas muncul dalam badan ketone darah (ketoacidosis).

Selepas penemuan insulin, banyak saintis mula membangunkan kaedah membersihkan ubat ini, kerana ia adalah kekotoran yang mempunyai kesan buruk terhadap tubuh yang lemah.

Agilent Technologies adalah peneraju global dalam peralatan analisis. Alat untuk analisis kromatografi dan spektral selama lebih dari setahun telah membantu saintis di seluruh dunia menyelesaikan masalah penting dalam farmaseutikal. Kawalan kesucian insulin tidak terkecuali. Sebelum ini, kromatografi cecair klasik digunakan untuk tujuan ini, sambil memperoleh keputusan yang agak boleh diterima:

Selepas banyak penyelidikan, saintis membuktikan bahawa polipeptida insulin yang terbentuk dengan berat molekul kira-kira 6000, dapat dikenal pasti dengan menggunakan perkembangan terkini dalam bidang kromatografi pengecualian.

Dengan kaedah baru ini, seseorang dapat membandingkan "insulin yang baik", yang disimpan dalam keadaan yang disyorkan dan "insulin yang buruk". Apabila dua kromatograms disemprotkan satu sama lain, ternyata bahawa dalam penyediaan insulin, yang disimpan di bawah keadaan yang buruk, molekul sasaran telah musnah dan sebaliknya, produk penguraian telah dikenalpasti pada kromatogram.

Pembangunan dan penyatuan kaedah analisis dan penyeragaman persediaan insulin menggunakan kromatografi cecair bertekanan tinggi fasa terbalik (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

Tesis disertasi ini perlu pergi ke perpustakaan dalam masa terdekat.
Maklumkan tentang kemasukan

Tesis - 480 Rubles, Penghantaran 10 minit, sekitar jam, tujuh hari seminggu dan cuti.

Abstrak - 240 rubel, penghantaran 1-3 jam, dari 10-19 (waktu Moscow), kecuali Ahad

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Pengembangan dan penyatuan kaedah analisis dan penyeragaman persiapan insulin menggunakan kromatografi cecair tekanan tinggi fasa terbalik (RP HPLC): disertasi. Calon Sains Farmasi: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Tempat perlindungan: Akademi Perubatan Moscow "].- Moscow, 2005.- 139 ms.: Il.

Kandungan untuk disertasi

BAB 1. Kajian literatur 11

1. Peranan insulin dalam rawatan diabetes mellitus 11

2. Biosintesis dan tindakan biologi insulin 12

3. Ciri umum sifat fizikokimia dan farmaseutikal insulin 15

4. Persediaan insulin 24

5. Kaedah pengeluaran, piawaian dan kawalan kualiti persediaan insulin 31

6. Penggunaan HPLC dalam analisis farmaseutikal insulin. 46

BAB 2. Penyata Masalah 50

BAB 3. Kajian mengenai pengaruh pelbagai faktor pada tingkah laku kromatografi insulin di bawah syarat RP HPLC 56

1. Kaedah dan bahan 57

2. Perbincangan hasil 62

2.1. Pengaruh komposisi penyelesaian penampan 62

2.2. Kesan kepekatan natrium sulfat 68

2.3. Kesan suhu lajur kromatografi 70

2.4. Kesan Pemodulat Organik 75

2.5. Pengaruh panjang radikal alkil fasa dicantumkan 80

2.6. Pengaruh panjang lajur kromatografi 80

BAB 4. Memperbaiki kaedah farmakopoeial untuk menganalisis persediaan insulin berdasarkan penggunaan RP HPLC 82

1. Pemilihan keadaan optimum untuk penentuan kromatografi insulin dan kekotoran dalam persediaan perubatan 82

2. Ciri-ciri metrologi kaedah 84

3. Pemakaian metodologi yang telah dibangunkan untuk ujian persiapan insulin rasmi 95

BAB 5. Pengembangan kaedah untuk analisis bentuk dos suntikan isophane-insulin berdasarkan kaedah PF HPLC

1. Pemilihan syarat untuk penentuan kromatografi protin dalam bentuk dos isophane-insulin 110

2. Kajian profil kromatografi protin yang diasingkan daripada pelbagai spesies ikan 121

3. Kaedah penentuan protamin dalam persediaan isophane-insulin 123

4. Pengesahan metodologi yang telah dibangunkan 125

Kesimpulan umum 136

Rujukan 139

Ciri-ciri umum ciri-ciri fizikokimia dan farmaseutikal insulin

Dari sudut pandangan kimia, insulin adalah protein globular kecil dengan berat molekul sehingga 6000 Da. Pada masa yang sama, perlu dicatat bahawa insulin adalah nama umum untuk seluruh keluarga protein homolog buatan asal dan tiruan dengan aktiviti biologi ciri umum. Sifat protein insulin telah ditubuhkan pada tahun 1928 [52]. Ia adalah antara protein yang menghasilkan reaksi biuret dan reaksi Pauli. Struktur insulin telah ditubuhkan sepenuhnya pada awal 50-an. Komposisi kimia asas insulina dari pelbagai asal dicirikan oleh angka-angka yang diberikan dalam jadual 1 [40].

Komposisi asid amino. Sebilangan besar molekul insulin mengandungi 51 residu asid amino, di antaranya ialah 17 asid amino yang terdapat dalam protein yang paling dikenali.

Ciri ciri komposisi asid amino lembu, babi dan insulin manusia adalah tryptophan dan metionin. Komposisi asid amino jenis insulin ini ditunjukkan dalam jadual 2 [40,46].

Invarian terhadap semua jenis insulin adalah kandungan cystine (6 sisa separuh cystine). Di samping itu, molekul insulin semua jenis mengandungi 6 kumpulan amide (asparagine, glutamine).

Apabila insulin dilepaskan, bersama-sama dengan pecahan utama, pecahan bentuk deamidated insulin dapat diperhatikan. Dalam persekitaran berasid, dalam proses deamidation, kesemua 6 kumpulan amide boleh beransur-ansur berpecah, dan mobiliti electrophoretic dan chromatographic perubahan insulin [40]. Pembentukan bentuk insulin deamidated boleh dinilai oleh keputusan penentuan ammonia. Untuk bentuk insulin penuh amida, 6 mol ammonia setiap 1 mol protein ditentukan, untuk bentuk deamidated, nilai ini mungkin dari 5 hingga 0.

Struktur utama insulin. Struktur utama insulin telah diuraikan oleh kumpulan Sanger pada tahun 1945-1955. Menggunakan beberapa kaedah kromatografi yang memungkinkan untuk memisahkan dan mengenal pasti pelbagai peptida, asid amino dan derivatifnya, Sanger dapat menetapkan struktur utama insulin biji [130,131,132,133,134,135]. Kajian lanjut insulin asal-usul yang berbeza dengan menggunakan pelbagai kaedah fiziko-kimia, termasuk kaedah Edman untuk menentukan keseluruhan urutan asid amino peptida panjang mengesahkan penemuan struktur Senger et al insulin [bb].

Sehingga kini, struktur utama insulin telah ditentukan dalam perwakilan 24 spesis milik 4 kelas haiwan: mamalia, burung, ikan, dan cyclostomes [14]. Penyelidikan mengenai insulin pelbagai asal berlanjutan [71,72,73].

Struktur insulin dalam haiwan yang berbeza adalah serupa, tetapi tidak sama. Dalam struktur utamanya, insulin manusia sama dengan babi, anjing, ikan paus sperma dan insulin kelinci, berbeza hanya dalam satu asid amino [40]. Ia berbeza daripada insulin lembu oleh tiga asid amino. Ke tahap yang lebih tinggi, insulin manusia tidak sama dengan insulin babi, burung dan ikan Guinean [40]. Perbezaan dalam urutan asid amino insulin manusia, babi, dan lembu ditunjukkan dalam Jadual 3.

Walaupun terdapat perbezaan struktur, semua jenis insulin mempunyai aktiviti biologi yang sama, iaitu menyebabkan kesan hipoglikemik. Walau bagaimanapun, magnitud aktiviti biologi yang dipaparkan sangat bergantung kepada spesies dan berada dalam lingkungan 11 IU / mg (insulin cod dari Laut Utara) hingga 62 IU / mg (insulin ayam belanda dan ayam), manakala aktiviti insulin manusia adalah kira-kira 25-30 IU / mg [40]. Semakin besar perbezaan interspisies, semakin besar perbezaan dalam aktiviti biologi insulin sepadan.

Molekul insulin aktif berfungsi terdiri daripada dua rantai polipeptida (rantai A dan B) yang dikaitkan dengan ikatan disulfida; satu ikatan dibentuk oleh sisa-sisa asid amino ketujuh bagi kedua-dua rantai tersebut, ikatan disulfida kedua dibentuk oleh residu ke-20 rantaian A dan sisa ke-19 rantaian B (Rajah 2). Di samping itu, terdapat ikatan disulfida ketiga dalam molekul insulin, iaitu intrachain dan menghubungkan residu rantaian A dan ke-11 [59,117].

Struktur sekunder Menggunakan pelbagai kaedah penyelidikan fizikokimia dan fizikal, ia menunjukkan bahawa molekul insulin mempunyai struktur ruang yang sangat diperintahkan (pengesahan), yang menyumbang kepada pelaksanaan fungsi biologi tertentu [14]. Dalam molekul insulin asli, kedua-dua helaian cc-helix dan p-fold hadir pada masa yang sama. Di samping itu, terdapat kawasan yang mempunyai struktur dan struktur yang tidak teratur <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Apabila larutan berasid insulin (pH 2.3-2.5) dipanaskan pada suhu +100 ° C dan disejukkan dengan cepat kepada -80 ° C, apa yang dipanggil insulin fibrillar terbentuk - bentuk hormon yang tidak aktif sepenuhnya [27]. Pengenalan gentian insulin gentian ke dalam larutan insulin aktif menyebabkan pemendakan kuantitatif secara spontan insulin dalam bentuk fibril [14,17].

Kaedah pengeluaran, piawaian dan kawalan kualiti persediaan insulin

Mendapatkan spesies insulin haiwan. Pengeluaran industri daging lembu dan daging babi insulin telah ditubuhkan hampir serentak di beberapa negara, tidak lama selepas penemuan insulin pada tahun 1921 [63]. Sejak itu, konsep mendapatkan insulin kekal hampir tidak berubah (jadual b) [17, 18]. Bahan mentah untuk pengeluaran spesis insulin haiwan adalah pankreas lembu penyembelih yang digunakan untuk makanan.

Tugas yang paling penting dalam pengeluaran insulin ialah pemurniannya - pelepasan bahan dari kekotoran yang berkaitan, yang mengurangkan aktiviti biologi, menyebabkan tindak balas imunologi, atau berpotensi membahayakan kesihatan pesakit. Contohnya, selepas beberapa tahun menggunakan insulin yang kurang bersih dalam darah pesakit, mungkin ada 5,000 IU insulin terikat kepada antibodi. Antibodi untuk insulin memberi kesan yang ketara kepada profil tindakannya dan, dengan itu, menyumbang kepada kursus labil diabetes.

Kaedah penyucian insulin pertama adalah penghabluran semula dengan kehadiran garam seng. Pada tahun 1945, ia telah menunjukkan bahawa penyulingan semula tujuh kali ganda insulin dengan ketara mengurangkan tahap tindak balas alahan pada pesakit, berbanding dengan persediaan insulin rasmi pada masa itu [63].

pengekstrakan berlawanan (PE), kromatografi partition (PX), pertukaran ion kromatografi (IOC) diskelek-troforeza (DEF), dan gel pengecualian kromatografi (GEH) [63] dengan menggunakan beberapa sampel insulin kaedah Kepelbagaian selepas penghabluran dan rancangan penghabluran tunggal.

Ia telah mendapati bahawa kekotoran utama adalah insulin seiring: proinsulin, perantaraan yang, dimer insulin kovalen, monodezamidoinsulin dan monoarginin monoetilinsulin, serta beberapa sebatian tinggi molekul tidak insulin semula jadi. kesimpulan umum daripada kajian, dengan mengambil maklumat akaun mengenai aktiviti imunologi dikesan kekotoran [138], kesimpulan adalah keperluan untuk pembersihan tambahan bahan insulin, supaya kaedah analisis dan DEF GEH mengesan satu komponen - insulin yang sepadan.

Untuk menyelesaikan masalah pemurnian insulin pada tahun 1950, kaedah HEC dicadangkan, dan pada tahun 1970, kaedah kromatografi pertukaran anion (AOX). Telah didapati bahawa insulin, yang disucikan oleh kaedah AOX, mengandungi kira-kira 500 ppm (bahagian per juta) kekotoran dengan aktiviti proinsulin [137]. Pemurnian tambahan insulin menggunakan kromatografi cecair tekanan tinggi pada fasa terbalik (RP HPLC) mengurangkan kandungan pecahan imunogenik kepada had pengesanan mereka [63].

Kajian semula perkembangan semasa dalam bidang pemurnian kromatografi insulin dibentangkan dalam [96]. Insulin, disucikan, berturut-turut, menggunakan IOC dan GEC, dipanggil insulin monokomponen [63]. Mendapatkan insulin manusia. Pencarian kaedah untuk mendapatkan insulin manusia adalah disebabkan oleh dua keadaan. Di satu pihak, masalah bahan mentah yang mendesak dalam hal pengeluaran insulin haiwan, sebaliknya, perkembangan sains yang pesat di kawasan ini memberikan peluang yang nyata untuk membawa ide kehidupan. Pada tahun 1979 dan 1981 hampir serentak, dua kaedah untuk mendapatkan insulin manusia telah dibangunkan - biosynthetic dan semi sintetik [102,108]. Pada tahun 1981, syarikat Novo Nordisk buat kali pertama di dunia memulakan pengeluaran siri insulin separuh sintetik manusia. Kaedah yang digunakan oleh syarikat adalah berdasarkan penggantian enzimatik dan kimia Al dalam molekul insulin porcine dengan baki Tre [61]. Kaedah ini secara langsung bergantung kepada mendapatkan jumlah insulin poros yang diperlukan, yang mengurangkan nilai ekonominya. Kemungkinan mendapatkan insulin manusia melalui kaedah biosintetik muncul dengan perkembangan teknologi DNA rekombinan [10]. Kerja-kerja pengeluaran insulin genetik bermula sekitar 25 tahun yang lalu. Pada tahun 1978, dilaporkan bahawa ketegangan E. coli menghasilkan tikus proinsou-ling diperolehi. Pada tahun 1979, kajian Genentech dapat mengklonkan E. coli gen-gen pengekodan urutan asid amino untuk. rantai insulin A dan B termasuk di r-poko-tacidase di plasmid pBR322 [10,102]. Pada tahun 1981 ia telah disintesis proinsulin gen analog - mini-proinsulin-C, di mana 35 kolitis segmen C-peptida digantikan dengan enam asid amino: arg-arg-Gly-ser-lys-arg dan menunjukkan rasa terhadap E.coli. Pada tahun 1982, syarikat Eli Lilly memulakan pengeluaran perindustrian insulin manusia pertama di dunia menggunakan dua teknologi rangkaian yang dibangunkan dengan kerjasama Genentech [102]. Pada masa ini, kemungkinan mendapatkan insulin manusia dengan bantuan pelbagai sistem ekspresi telah ditunjukkan [3,10,101,102]. Dari sudut pandangan ekonomi, penggunaan strain E.coli bakteria gram positif yang diubahsuai secara genetik, kebanyakannya dianggap terlalu berlebihan, mempunyai minat khusus [3]. Pada masa yang sama, kemajuan penting dicapai dengan sel-sel yis Saccharomices cerevisiae [3.75]. Jadual 7 menyenaraikan utama, biasa dengan pelbagai kaedah menghasilkan insulin manusia rekombinan, tahap proses teknologi [3,10,63].

Penggunaan metodologi yang telah dibangunkan untuk ujian persediaan insulin rasmi

Tekanan tinggi Chromatography Liquid (HPLC) - Variant lajur kromatografi cecair, di mana fasa bergerak - eluent - mengisi ruang melalui sorbent pada kelajuan yang tinggi kerana tekanan yang besar (sehingga 400h105 Pa) pada kemasukan tiang [11].

Sebagai cara untuk menganalisis campuran bahan yang kompleks, HPLC muncul sedikit lebih dari 30 tahun yang lalu. Penggunaan sorben dengan diameter zarah 3-10 μm menyebabkan peningkatan ketara dalam kecekapan pemisahan kromatografi berbanding dengan versi klasik kromatografi cecair lajur. Oleh itu, HPLC sering dirujuk sebagai kromatografi cair prestasi tinggi (HPLC). Ciri-ciri penting penggunaan HPLC dijelaskan secara terperinci dalam banyak manual [49.50] dan di bahagian yang relevan dari farmakope terkemuka [79.150]. Pelbagai sorben telah dibangunkan dan tersedia untuk HPLC. Menurut penulis tinjauan [51] - kira-kira 100 firma di seluruh dunia menghasilkan lebih daripada 300 jenis nama sorben. Sejarah, keadaan semasa dan prospek untuk pembangunan kaedah dibincangkan dalam ulasan [51] dan [77.78].

Dalam pelbagai variannya, kaedah HPLC digunakan secara meluas dalam analisis farmaseutikal (kawalan pengeluaran dan pengujian kualiti ubat). Kaedah ini dimasukkan ke dalam semua farmakopoei terkemuka di dunia. Kaedah ini paling digambarkan dalam Pharmacopoeias Eropah dan Amerika. HPLC digunakan untuk mengenal pasti ubat, untuk menentukan ketulenan, komposisi pecahan berat molekul dan analisis kuantitatif. Di Amerika Syarikat Pharmacopoeia 28 ed. kira-kira 30% artikel peribadi melibatkan penggunaan HPLC. Di Eropah Pharmacopeia ed. angka ini adalah kira-kira 40%.

Kaedah kromatografi pertama untuk ujian insulin ialah kromatografi cecair pengecutan gel tekanan rendah (GE ZhND). Prinsip pemisahan di bawah syarat-syarat HPLC adalah berdasarkan keupayaan molekul yang berbeza dengan saiz yang berbeza untuk menembusi liang gel neutral, yang berfungsi sebagai fasa pegun. Diameter hidrodinamik monomer dan dimer insulin adalah berkadar dengan berat molekul mereka dan masing-masing adalah 2.69 dan 5.50 nm [115].

Pada tahun 1967, menggunakan kaedah GE-IHDD, ditunjukkan bahawa persediaan komersial insulin, disucikan oleh penghabluran, mengandungi kekotoran dengan berat molekul melebihi berat molekul insulin [63]. Pada kromatograms insulin porcine, tiga puncak dijumpai, secara konvensional ditetapkan sebagai komponen a, b dan c. Sejak itu, beberapa sistem kromatografi telah dicadangkan untuk mengawal kandungan kekotoran berat molekul tinggi dalam persediaan insulin. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan bungkus agarose xerogels (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Atau dextran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), larutan asid asetik 1-3 M digunakan sebagai IF [127]. Kepekaan yang tinggi terhadap sorben ini untuk mampatan pada tekanan yang melebihi tekanan bengkak matriks menjadikan bahan-bahan ini tidak sesuai untuk operasi dalam mod HPLC.

Penggunaan kromatografi cecair pengecualian gel pada tekanan tinggi (GE HPLC) untuk analisis insulin telah dijelaskan dahulu pada tahun 1980, selepas pembangunan keras sorben keras yang serasi dengan air dan menahan tekanan tinggi. Dalam [151], pemisahan dilakukan pada kolum Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) di bawah keadaan penentuan (gabungan larutan 7 urea, asid mineral dan bukan ionik detergen). Keperluan untuk analisis insulin di bawah keadaan penentuan adalah berkaitan dengan keupayaan insulin untuk agregat dalam larutan. Bagi pemisahan insulin di bawah keadaan HPLC HPLC, penggunaan asid asetik larut "tradisional" juga telah diterangkan [152]. Penggunaan asid asetik mempunyai beberapa kelebihan - kesan minimum terhadap struktur asli dari senyawa yang dipisahkan, ketersediaan, kos rendah, sebagai tambahan, fakta penting ialah keupayaan asid asetik untuk menindas persatuan insulin.

Pada masa ini, HPLC ghvd adalah kaedah farmakopoeial untuk memantau kandungan kekotoran berat molekul yang tinggi dalam bahan-bahan dan bentuk dos selesai. Kaedah ini juga digunakan untuk menentukan kandungan protin dalam persediaan isophane-insulin.

Penggunaan HPLC pada fasa terbalik (HP HPLC) untuk pemisahan lembu dan insulin porcine buat kali pertama menunjukkan kecekapan tinggi kaedah ini untuk analisis peptida seperti insulin dengan struktur yang serupa.

Mekanisme pemisahan protein dan polipeptida di bawah syarat-syarat RP HPLC adalah berdasarkan kepada hidrofobisiti berbeza molekul insulin dan kekotoran yang berkaitan. Sehingga kini, beberapa berpuluh-puluh kaedah untuk pemisahan kromatografi insulin dari pelbagai asal dan derivatif mereka, termasuk proin-sulin, polipeptida pankreas, derivatif dezamido, dimer insulin, telah diterangkan. [126] menunjukkan kemungkinan memisahkan insulin ayam, arnab, biri-biri dan kuda. Manusia, daging lembu dan insulin babi juga dipisahkan. Lloyd dan Corran menerbitkan satu cara untuk memisahkan daging lembu, daging babi, insulina manusia dan bentuk-bentuk yang disifatkan sesuai [104].

Pemisahan dijalankan pada sorben gel silika yang diubahsuai, metil, butil, oktil, oktadekil dan kumpulan fenil dalam mod isocratic atau kecerunan. Sebagai PF, pengubah organik digunakan - asetonitril, metil alkohol, isopropil alkohol, bercampur dengan larutan penampung berair yang mengandungi garam anorganik dan reagen ion-wap. Pengesanan puncak dijalankan terutamanya oleh kaedah spektrofotometri pada panjang gelombang 190-220 nm, kaedah fluorimetrik juga diterangkan [103].

Analisis bahan dan bentuk dos insulin yang telah selesai menggunakan RP HPLC dijelaskan dalam artikel peribadi di Amerika dan Eropah Pharmacopoeia [79.150]. Kaedah ini digunakan untuk menguji dadah kumpulan tertentu dari segi "Keaslian Insulin", "Protein Terkait", "Penentuan Kuantitatif" dan "Insulin dalam Penyelesaian".

Sastera penyelidikan juga menerangkan penggunaan kromatografi pertukaran dan ion pertindihan untuk analisis insulin [44,102], namun kaedah-kaedah ini tidak digunakan secara meluas dalam amalan farmakopoeial.

Pilihan keadaan untuk penentuan kromatografi protinine dalam bentuk dos isophane-insulin

Peningkatan kekuatan ion PF biasanya membawa kepada peningkatan nisbah kapasiti insulin, yang boleh disebabkan oleh beberapa faktor: - Meningkatkan kepekatan ion mengurangkan tahap pengionan kumpulan yang dikenakan protein molekul, meningkatkan hidrofobiknya / - kepekatan tinggi kation menyumbang kepada penapisan kumpulan silanol bebas pada permukaan pegun satu fasa yang melemahkan interaksi elektrostatik yang tidak spesifik kumpulan-kumpulan amino protonasi protein dengan matriks; - Kekuatan ionik yang tinggi memberi kesan kepada struktur ruang insulin, hasilnya permukaan yang tersedia untuk berinteraksi dengan perubahan sorben. Kepekatan garam anorganik dalam FS memberi kesan kepada bentuk puncak dan pemilihan pemisahan insulin dan desamido-Asn-insulin [143,144]. Dengan elusi isokumen pada LiChrosorb Sust sorbent dengan larutan 0.1 M natrium fosfat (pH 2.3), hasil yang memuaskan dicapai hanya apabila natrium sulfat ditambah kepada larutan penampan kepada kepekatan 0.1 M. Kaedah analisis kebanyakan insulin termasuk dalam artikel farmakopoeial dan ND, gunakan PF berdasarkan penyelesaian penampan dengan kandungan natrium sulfat bersamaan dengan 0.2 M. Kandungan kandungan natrium sulfat yang tinggi akan menjejaskan kebolehulangan hasil kromatografi kerana stratifikasi eluen, lebih-lebih lagi, Penyelesaian garam yang sangat tertumpu mempunyai kesan negatif ke atas peralatan kromatografi, memendekkan hayat perkhidmatannya. Memandangkan kaedah analisis farmakopoeial telah dibangunkan lebih dari 20 tahun yang lalu, nampaknya menarik untuk mengkaji tingkah laku kromatografi insulin di bawah OF-HPLC pada sorben kromatografi generasi terkini bergantung kepada kepekatan natrium sulfat. Pada masa yang sama, mereka cuba untuk mengetahui sama ada pengurangan kandungan natrium sulfat dalam PF adalah dibenarkan tanpa kemerosotan yang ketara dalam keupayaan pemisahan sistem kromatografi. Hasil daripada penyelidikan itu didapati bahawa kesan kepekatan natrium sulfat dalam PF adalah berbeza, bergantung pada jenis fasa dicantumkan, dan juga pada spesies insulin. Pada sorben dengan kumpulan yang dicantumkan C4 dan C pemilihan pemisahan puncak insulin manusia dan desamido-Asn-insulin manusia tidak bergantung kepada kepekatan natrium sulfat di. penyelesaian buffer1 dalam julat dari 0.05 M hingga 0.2 M. Pada Diaspher-110-C18 sorbent, pemilihan pasangan pemisahan ini mempunyai maksimum pada 0.05 M dan minimum pada 0.1 M (carta 4). Di sisi lain, pemilihan pemisahan spesis insulin haiwan dan bentuk asnA21 yang sesuai desamidated tidak bergantung kepada kekuatan ionik penyelesaian apabila ia dipisahkan di Diasphere-110-C18 sorben. Pada sorben dengan kumpulan C8 dicelup, selektiviti meningkat dari 1.25 hingga 1.28 dengan peningkatan kepekatan natrium sulfat (angka 4). Pada sorben dengan kumpulan C4 yang dicantumkan, pemilihan pemisahan dalam kes insulin daging lembu adalah maksimum pada 0.1 M natrium sulfat dan minimum pada 0.2 M. Bagi insulin daging babi, tiada ketinggian maksimum pada kepekatan natrium sulfat 0.1 M, dalam kes ini peningkatan dalam ionik tentera membawa kepada pengurangan pemilihan pemisahan (angka 4). Bilangan plat teori yang berkesan meningkat dengan peningkatan kepekatan natrium sulfat. Pengecualian adalah tingkah laku insulin manusia terhadap penyinaran Diasfer-110-C8 (angka 5). Tahap pemisahan puncak insulin dan desamido-Asn-insulin meningkat dengan peningkatan kekuatan ion FS, tidak kira spesies insulin dan jenis fasa dicantumkan (gambar b). Dengan mengurangkan kepekatan natrium sulfat dari 0.2 M hingga 0.1 M, tahap pemisahan pasangan puncak terpilih berkurangan secara purata sebanyak 5% untuk insulin manusia dan porcine, dan sebanyak 10% untuk insulin daging lembu. Memandangkan fakta bahawa nilai mutlak tahap pemisahan melebihi 2.0, kemerosotan yang diukur dalam kapasiti pemisahan lajur, pada pendapat kami, tidak ketara. Oleh itu, kepekatan natrium sulfat dalam larutan penampan PF dapat dikurangkan sebanyak 2 kali berbanding dengan kaedah analisis farmakopoeial.

Dalam kebanyakan kajian mengenai analisis protein dan peptida, pemisahan itu dilakukan pada suhu bilik. Tambahan pula, sesetengah penulis menunjukkan bahawa kesan suhu pada pemilihan pemisahan adalah minimum [48]. Walau bagaimanapun, apabila suhu meningkat, proses pertukaran jisim di antara fasa pegun dan mudah alih dipercepatkan, yang menyebabkan penurunan dalam masa pengekalan peptida dan penyempitan puncak.

Teknologi Insulin

Pelanggaran sekatan insulin. Penggunaan fotografi sekutu. Skim untuk insulin. Ungkapan proinsulin dalam sel E. coli. Pendekatan untuk menyelesaikan masalah diabetes. Sumbangan bioteknologi kepada pengeluaran perindustrian hormon bukan peptida.

Hantar kerja yang baik dalam asas pengetahuan adalah mudah. Gunakan borang di bawah.

Pelajar, pelajar siswazah, saintis muda yang menggunakan asas pengetahuan dalam kajian dan kerja mereka akan sangat berterima kasih kepada anda.

Dihantar pada http://www.allbest.ru/

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN SAINS REPUBLIK KAZAKHSTAN

KAZAKH UNIVERSITI AGRO-TECHNICAL NAMED SELEPAS S.SEYFULLIN

Jabatan Mikrobiologi dan Bioteknologi

Mengenai disiplin "Biokechnology mokroorganizmov"

Mengenai topik: teknologi untuk insulin

Selesai: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Diperiksa: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

TERDATANG DAN SIMBOL

1. Sejarah penemuan

2. Mendapatkan insulin dalam bioteknologi

3. Cara untuk mendapatkan insulin manusia

4. Ekspresi proinsulin dalam sel E. coli

5. Pembersihan insulin

6. Dos dan pentadbiran

Dalam kursus ini digunakan definisi berikut:

Pembawa protein - menyediakan pengangkutan protein hibrid dalam ruang periplasmik medium sel atau kultur;

Komponen afinitas - dengan ketara memudahkan pemilihan protein hibrid.

Insulin (dari bahasa Latin Insula - pulau) - hormon peptida, terbentuk dalam sel-sel beta di pulau-pulau kecil Langerhans pankreas.

Interleukins adalah sekumpulan cytokine yang disintesis terutamanya oleh leukosit (untuk sebab ini, "-leukin" yang telah dipilih).

Proinsulin adalah prekursor insulin yang disintesis oleh sel B dari alat pankreas bersifat insula.

Kromatografi (kroma Greek, chromatos -. Cat warna), kaedah fiziko-kimia untuk mengasingkan dan menganalisis campuran daripadanya, berdasarkan pengagihan komponen antara dua fasa - mudah alih (eluent) tetap dan mengalir melalui pegun.

Encapsulation - mekanisme bahasa pengaturcaraan yang menyekat akses kepada komponen yang membentuk objek (kaedah dan sifat), menjadikannya peribadi, iaitu, hanya boleh diakses dalam objek.

Protein gabungan (fusionprotein, juga protein sebatian chimeric) adalah protein yang diperoleh dengan menggabungkan dua atau lebih gen yang asalnya dikodkan protein berasingan.

Hormon (berasal dari bahasa Yunani Hormao - membawa kepada gerakan, induksi), hormon, bahan aktif secara biologi yang dihasilkan oleh kelenjar endokrin atau kelenjar endokrin, dan dirahsiakan oleh mereka terus ke dalam darah.

Diabetes mellitus adalah sekumpulan penyakit endokrin, yang berkembang akibat insufisiensi insulin hormon mutlak atau relatif.

Encapsulation - mekanisme bahasa pengaturcaraan yang menyekat akses kepada komponen yang membentuk objek (kaedah dan sifat), menjadikannya peribadi, iaitu, hanya boleh diakses dalam objek.

Somatostatin adalah hormon sel delta dari pankreas pulau Langerhans, serta salah satu hormon hipotalamus.

Radioimunocerakinan - Kaedah penentuan kuantitatif bahan-bahan biologi aktif Dalam cecair biologi, berdasarkan mengikat kompetitif radionuklid bahan dilabel stabil dan sama yang dikehendaki mengikat kepada sistem tertentu (hormon, enzim, dadah, dan lain-lain.).

TERDATANG DAN SIMBOL

HPLC - Kromatografi Cecair Prestasi Tinggi

cDNA - asid deoksiribonukleik pelengkap

Fungsi utama insulin adalah untuk memastikan kebolehtelapan membran sel untuk molekul glukosa. Dalam bentuk yang mudah, ia boleh dikatakan bahawa bukan sahaja karbohidrat, tetapi juga mana-mana nutrien, akhirnya melekang kepada glukosa, yang digunakan untuk sintesis molekul karbon yang mengandungi lain, dan satu-satunya jenis loji kuasa bahan api sel - mitokondria. Tanpa insulin, kebolehtelapan sel membran ke glukosa jatuh 20 kali ganda, dan sel-sel mati akibat kebuluran, dan gula berlebihan dibubarkan dalam racun darah badan.

Kemerosotan sekresi insulin disebabkan oleh pemusnahan sel beta - kekurangan insulin mutlak - adalah elemen utama dalam patogenesis diabetes mellitus jenis 1. Pelanggaran terhadap insulin pada tisu - kekurangan insulin relatif - mempunyai tempat penting dalam perkembangan diabetes jenis 2.

Penggunaan kromatografi afinasi telah mengurangkan kandungan protein yang tercemar dalam penyediaan dengan berat molekul yang lebih tinggi daripada insulin. Protein seperti itu termasuk proinsulin dan proinsulin yang dipecah sebahagian, yang dapat mendorong pengeluaran antibodi antinsulin.

Penggunaan insulin manusia dari awal terapi meminimumkan berlakunya reaksi alahan. Insulin manusia diserap dengan lebih cepat dan, tanpa mengira bentuk dadah, mempunyai tempoh tindakan yang lebih pendek daripada insulin haiwan. Insulin manusia kurang immunogens daripada daging babi, terutama bovine campuran dan insulin babi.

Tujuan kursus ini ialah mengkaji teknologi insulin. Untuk mencapai matlamat berikut telah ditetapkan:

1. mendapatkan insulin dalam bioteknologi

2. Cara untuk mendapatkan insulin

H. Pemurnian Insulin

Sejarah penemuan insulin dikaitkan dengan nama doktor Rusia I.M. Sobolev (separuh kedua abad ke-19), yang membuktikan bahawa tahap gula dalam darah manusia dikawal oleh hormon khusus pankreas.

Pada tahun 1922, insulin diekstrak daripada pankreas haiwan, pertama kali diperkenalkan budak lelaki berusia sepuluh tahun dengan diabetes hasil carian mana melebihi semua jangkaan, dan setahun kemudian syarikat Amerika «Eli Lilly» mengeluarkan produk pertama insulin haiwan.

Selepas menerima insulin kumpulan pertama industri dalam beberapa tahun akan datang, cara pemisahan dan pembersihan yang besar telah diliputi. Akibatnya, hormon ini boleh didapati untuk pesakit diabetes jenis 1.

Pada tahun 1935, penyelidik Denmark Hagedorn mengoptimumkan tindakan insulin dalam badan dengan mencadangkan ubat yang berpanjangan.

Kristal insulin pertama diperoleh pada tahun 1952, dan pada tahun 1954, ahli biokimia Inggeris G. Senger menguraikan struktur insulin. Pengembangan kaedah untuk pemurnian hormon dari bahan dan produk hormon lain yang menyebabkan kemerosotan insulin memungkinkan untuk mendapatkan insulin homogen, yang dipanggil insulin komponen tunggal.

Pada awal 70-an. Saintis Soviet A. Yudaev dan S. Shvachkin mencadangkan sintesis kimia insulin, bagaimanapun, pelaksanaan sintesis ini pada skala industri adalah mahal dan tidak menguntungkan.

Pada masa akan datang, terdapat peningkatan progresif dalam tahap pemurnian insulin, yang mengurangkan masalah yang disebabkan oleh alahan insulin, fungsi buah pinggang terjejas, gangguan visual dan rintangan insulin imun. Hormon yang paling berkesan diperlukan untuk terapi penggantian dalam diabetes mellitus - insulin homolog, iaitu insulin manusia.

Dalam 80 tahun kemajuan dalam biologi molekul membenarkan disintesis menggunakan E.coli kedua-dua rantai insulin manusia, yang kemudiannya dihubungkan dengan molekul biologi aktif, hormon, dan Institut Bioorganic Kimia insulin rekombinan disediakan dengan menggunakan jenis E.coli kejuruteraan genetik.

2. Mendapatkan insulin dalam bioteknologi

Insulin, hormon peptida pankreas pulau kecil Langerhans, adalah rawatan utama untuk diabetes mellitus. Penyakit ini disebabkan oleh kekurangan insulin dan ditunjukkan oleh peningkatan tahap glukosa darah. Sehingga baru-baru ini, insulin diperoleh dari pankreas seekor lembu dan babi. Ubat ini berbeza daripada insulin manusia 1-3 penggantian asid amino, supaya ada ancaman reaksi alergi, terutama pada kanak-kanak. Penggunaan terapeutik insulin berskala besar dikekang oleh kos yang tinggi dan sumber yang terhad. Dengan pengubahsuaian kimia, insulin dari haiwan dibuat tidak dapat dibezakan dari manusia, tetapi ini bermakna peningkatan tambahan dalam kos produk. [1]

Sejak tahun 1982, Eli Lilly telah menghasilkan insulin kejuruteraan genetik berdasarkan sintesis berasingan E. colie - dan B-rantai. Kos produk telah menurun dengan ketara, insulin yang dihasilkan adalah sama dengan manusia. Sejak tahun 1980, terdapat laporan dalam akhbar mengenai kloning gen proinsulin, prekursor hormon, yang melewati bentuk matang dengan proteolysis terhad.

Teknologi enkapsulasi juga dilampirkan kepada rawatan kencing manis: sel pankreas dalam kapsul, diperkenalkan sekali ke dalam tubuh pesakit, menghasilkan insulin dalam masa satu tahun.

Genetik Bersepadu telah melancarkan pengeluaran hormon folikel-merangsang dan luteinizing. Peptida ini terdiri daripada dua subunit. Dalam agenda adalah persoalan sintesis industri hormon oligopeptida sistem saraf, ankephalin, yang dibina daripada 5 sisa asid amino, dan endorphin, analog morfin. Dengan penggunaan rasional peptida ini melegakan kesakitan, mewujudkan mood yang baik, meningkatkan kecekapan, menumpukan perhatian, meningkatkan memori, meletakkan tidur dan terjaga. Contoh penerapan kaedah kejuruteraan genetik yang berjaya adalah sintesis β-endorphin menggunakan teknologi protein hibrid yang diterangkan di atas untuk satu lagi hormon peptida, somatostatin [2].

3. Cara untuk mendapatkan insulin manusia

Dari segi sejarah, cara pertama untuk mendapatkan insulin untuk tujuan terapeutik ialah mengasingkan analog hormon ini dari sumber semula jadi (pankreas lembu dan babi). Dalam 20-an abad yang lalu, ia telah mendapati bahawa bovine dan insulin babi (yang paling serupa dengan insulin manusia dalam struktur dan asid amino urutan) dalam aktiviti pameran tubuh manusia setanding dengan insulin manusia. Selepas itu, baka atau biji insulin digunakan untuk masa yang lama untuk merawat pesakit diabetes jenis 1. Walau bagaimanapun, selepas beberapa ketika, ditunjukkan bahawa dalam beberapa kes, antibodi untuk bovine dan porosin insulin mula berkumpul di dalam tubuh manusia, dengan itu membatalkan kesannya.

Sebaliknya, salah satu kelebihan kaedah mendapatkan insulin ialah ketersediaan bahan mentah (insulin sapi dan biri-biri boleh diperoleh dengan mudah dalam kuantiti yang banyak), yang memainkan peranan penting dalam pembangunan kaedah pertama untuk mendapatkan insulin manusia. Kaedah ini dipanggil separuh sintetik [3].

Dalam kaedah ini menghasilkan insulin manusia, insulin porcine digunakan sebagai bahan mentah. Insulin porcine yang dibersihkan telah dipotong oleh octapeptide C-terminal dari rantaian B, selepas itu octapeptide C-terminal insulin manusia telah disintesis. Kemudian ia dilampirkan secara kimia, kumpulan pelindung dikeluarkan dan insulin yang diperoleh disucikan. Apabila menguji kaedah ini untuk mendapatkan insulin, identiti lengkap hormon yang diperolehi untuk insulin manusia ditunjukkan. Kekurangan utama kaedah ini adalah kos tinggi insulin yang dihasilkan (walaupun sekarang sintesis kimia octapeptide mahal, terutama pada skala perindustrian).

Pada masa ini, insulin manusia didapati dalam dua cara: dengan mengubah insulin daging babi dengan kaedah sintetik-enzimatik dan kaedah kejuruteraan genetik.

Dalam kes pertama, kaedah ini didasarkan pada fakta bahawa insulin porcine berbeza dari insulin manusia dengan satu penggantian pada terminal C-Ala30Thr B-. Penggantian alanin dengan threonine dilakukan oleh pembelahan alanine enzim catalyzed dan, sebaliknya, melampirkan residu threonine terlindung karboksil yang hadir dalam campuran reaksi dalam lebihan yang besar. Selepas pembelahan kumpulan O-tert-butil pelindung, insulin manusia diperolehi. (gambar 1)

Rajah 1 - Diagram kaedah untuk menghasilkan insulin manusia

Insulin adalah protein pertama yang diperolehi untuk tujuan komersil menggunakan teknologi DNA rekombinan. Terdapat dua pendekatan utama untuk mendapatkan insulin manusia yang direka bentuk secara genetik. Dalam kes pertama, berasingan (strain pengeluar yang berbeza) menghasilkan kedua-dua rantai diikuti oleh lipatan molekul (pembentukan jambatan disulfida) dan pemisahan misoform. Pada kedua, persiapan dalam bentuk prekursor (proinsulin) diikuti dengan belahan enzimatik dengan trypsin dan karboksipeptidase. Masuk ke bentuk aktif hormon. Yang paling disukai sekarang adalah penghasilan insulin sebagai prekursor, memastikan penutupan jambatan disulfide yang betul (dalam hal pengeluaran rantai berasingan, kitaran denaturasi berturut-turut, pemisahan misoform dan renaturation dilakukan [3].

Dalam kedua-dua pendekatan, adalah mungkin kedua-dua individu untuk mendapatkan komponen permulaan (Rantai A dan B atau proinsulin), dan sebagai sebahagian daripada protein hibrid. Sebagai tambahan kepada A- dan B-rantai atau proinsulin, mungkin terdapat dalam komposisi protein hibrid:

1) protein pembawa - memastikan pengangkutan protein hibrid ke dalam ruang periplasmik medium sel atau budaya;

2) komponen afiniti - dengan ketara memudahkan pemilihan protein hibrid.

Pada masa yang sama, kedua-dua komponen ini boleh secara serentak hadir dalam komposisi protein hibrid. Di samping itu, apabila mencipta protein hibrid, prinsip multidimensiiti boleh digunakan (iaitu, beberapa salinan polipeptida sasaran hadir dalam protein hibrid), yang memungkinkan untuk meningkatkan hasil produk sasaran secara ketara [4].

Kami menggunakan strain JM 109 N1864 dengan urutan nukleotida yang tertanam dalam plasmid yang menyatakan protein hibrid, yang terdiri daripada proinsulin linier dan serpihan kepingan protein Astaphylococcusaureus yang melekat pada terminal Nnya melalui residu metionin. Penanaman biomas tepu sel strain rekombinan memastikan permulaan pengeluaran protein hibrid, pengasingan dan transformasi sekuriti yang oleh intube membawa kepada insulin. Satu lagi kumpulan penyelidik yang diterima dalam sistem penyuraian bakteria adalah protein rekombinan gabungan yang terdiri daripada proinsulin manusia dan ekor polyhistidine yang melekatinya melalui residu metionin. Ia telah diasingkan menggunakan kromatografi chelate pada lajur Ni-agarose dari badan kemasukan dan dicerna dengan sianogen bromida. Penulis menentukan bahawa protein terpencil adalah S-sulfur. Analisis spektrometri pemetaan dan massa dari proinsulin yang diperoleh, yang dibersihkan oleh kromatografi pertukaran ion pada penukar anion dan RP (fasa terbalik) HPLC (kromatografi cair prestasi tinggi), menunjukkan kehadiran jambatan disulfida yang bersamaan dengan jambatan disulfida proinsulin manusia asli. Ia juga melaporkan tentang perkembangan kaedah yang baru dan lebih baik untuk mendapatkan insulin manusia melalui kaedah kejuruteraan genetik dalam sel prokariotik. Penulis mendapati bahawa insulin yang diperolehi dalam struktur dan aktiviti biologi adalah sama dengan hormon yang terisolasi dari pankreas [5].

Baru-baru ini perhatian telah diberikan untuk memudahkan prosedur untuk menghasilkan insulin rekombinan oleh kaedah kejuruteraan genetik. Oleh itu, protein gabungan yang terdiri daripada peptida pemimpin interleukin yang melekat pada terminal N-proinsulin diperolehi melalui residu lisin. Protein itu diekspresikan dengan cekap dan dilokalkan dalam badan kemasukan. Setelah pemisahan, protein dipotong dengan trypsin untuk menghasilkan insulin dan C-peptida. Satu lagi kumpulan penyelidik bertindak dengan cara yang sama. Protein gabungan yang terdiri daripada proinsulin dan dua domain sintetik Staphylococcus protein A, yang mengikat IgG, telah dilokalkan dalam badan kemasukan, tetapi mempunyai tahap ekspresi yang lebih tinggi. Protein telah diasingkan oleh kromatografi afiniti menggunakan IgG dan dirawat dengan trypsin dan carboxypeptidase B. Insulin dan C-peptida yang dihasilkan disucikan oleh RP-HPLC. Apabila mencipta struktur gabungan, nisbah massa protein pembawa kepada polipeptida sasaran sangat penting. Ini adalah bagaimana reka bentuk pembinaan fusion dijelaskan, di mana protein yang mengikat serum albumin manusia digunakan sebagai polipeptida pembawa. Satu, tiga dan tujuh C-peptida dilampirkan kepadanya. C-peptida digabungkan di atas kepala ekor menggunakan spacer asid amino yang membawa tapak pembatas Sfi I dan dua residu arginine pada mulanya dan pada akhir spacer untuk pembelahan protein seterusnya dengan trypsin. Produk pembelotan HPLC menunjukkan bahawa C-peptida dipotong secara kuantitatif, dan ini membolehkan menggunakan kaedah gen sintetik multimerik untuk menghasilkan polipeptida sasaran pada skala perindustrian.

Mendapatkan proinsulin mutan, yang mengandungi penggantian Arg32Tyr. Dengan pembekuan bersama protein ini dengan trypsin dan carboxypeptidase B, insulin asli dan C-peptida yang mengandungi residu tirosin terbentuk. Yang terakhir, selepas penandaan 125I, digunakan secara aktif dalam radioimmunoassay [6].

Kawalan Kualiti Insulin

Kandungannya

1. Maklumat am tentang mendapatkan insulin 5

2. Kaedah yang digunakan untuk mengawal kualiti insulin 8

Rujukan 17

Petikan daripada kerja

1-2% daripada populasi Eropah menderita diabetes, dan kira-kira 20% daripada pesakit ini tidak boleh wujud tanpa suntikan insulin. Sejak eksperimen pertama mengenai penggunaan insulin untuk rawatan kencing manis pada tahun 1922, hormon ini diasingkan dari pankreas haiwan (lembu dan babi). Insulin haiwan sedikit berbeza dalam urutan asid amino daripada insulin manusia.

Insulin manusia dan babi amat rapat: dalam insulin babi, threonine C-terminal dari rantai B digantikan oleh alanine. Sapi dan insulin manusia berbeza dalam tiga residu asid amino. Ia adalah perbezaan yang menentukan peningkatan imunogenik insulin biji berbanding dengan insulin babi.

Hampir semua pesakit yang dirawat dengan insulin lembu mempunyai antibodi untuk insulin dalam darah. Sifat antigenik insulin juga sebahagiannya ditentukan oleh kekotoran dalam persediaannya. Kemungkinan besar, ia adalah pembentukan antibodi kepada insulin yang menjelaskan beberapa kesan sampingan kecil apabila menyuntikkan insulin lembu, sebagai contoh, atropi lemak subkutan dalam tapak suntikan semula. Dalam kes insulin yang sangat dimurnikan, kesannya tidak hadir.

Selepas itu, terima kasih kepada kejuruteraan genetik dan menggunakan E. Coli, insulin manusia diperolehi.

Insulin manusia, yang diperolehi oleh E. coli, adalah protein "genetik berstruktur" pertama yang diuji pada manusia. Dalam eksperimen dengan sukarelawan yang sihat, didapati selamat (tidak menyebabkan reaksi alahan dan lain-lain yang tidak diingini) dan mempunyai keupayaan untuk mengurangkan tahap glukosa dalam darah apabila ditadbirkan di bawah kulit atau intravena.

Pada masa ini, insulin manusia seperti ini diperolehi oleh ramai pesakit kencing manis di seluruh dunia. Ini didahului oleh ujian klinikal di mana perubahan metabolik dan kesan imunologi dikaji.

Perkaitan topik kami ialah pengeluaran yang tidak terkawal atau tidak terkawal boleh menyebabkan pembebasan persediaan insulin yang tercemar, yang seterusnya boleh membawa kepada kesan klinikal yang buruk.

Tujuan kerja ini adalah untuk mengkaji kaedah yang digunakan dalam kawalan mutu insulin.

Rujukan

GOST R 52249-2004 "Kaedah pengeluaran dan kawalan mutu ubat" 2004

OFS 42-0002-00 "endotoxin bakteria" 2000

OFS 42-0126-09 "Ujian biologi insulin"

Artikel farmakopoeial Persekutuan Rusia FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Kejuruteraan genetik insulin manusia: kejayaan dan prospek // Kimia kimia Rusia. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - ms 34-45.

Goncharenko G.G. Asas bioteknologi: Kaedah pengajaran. kompleks untuk stud.biolog. istimewa / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min arr. RB. - Gomel: EI "GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 p.

Ryabko, Yu A, Lukin, OV, Shepel, E.N. Penggunaan kaedah kinetik-kromogenik untuk menentukan endotoxin bakteria (LAL-test) dalam teknologi pemurnian insulin manusia kejuruteraan genetik // jurnal Biopharmaceutical - 2009. - Vol. - №1. - ms 34-37.