Pembangunan dan penyatuan kaedah analisis dan penyeragaman persediaan insulin menggunakan kromatografi cecair bertekanan tinggi fasa terbalik (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

  • Diagnostik

Tesis disertasi ini perlu pergi ke perpustakaan dalam masa terdekat.
Maklumkan tentang kemasukan

Tesis - 480 Rubles, Penghantaran 10 minit, sekitar jam, tujuh hari seminggu dan cuti.

Abstrak - 240 rubel, penghantaran 1-3 jam, dari 10-19 (waktu Moscow), kecuali Ahad

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Pengembangan dan penyatuan kaedah analisis dan penyeragaman persiapan insulin menggunakan kromatografi cecair tekanan tinggi fasa terbalik (RP HPLC): disertasi. Calon Sains Farmasi: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Tempat perlindungan: Akademi Perubatan Moscow "].- Moscow, 2005.- 139 ms.: Il.

Kandungan untuk disertasi

BAB 1. Kajian literatur 11

1. Peranan insulin dalam rawatan diabetes mellitus 11

2. Biosintesis dan tindakan biologi insulin 12

3. Ciri umum sifat fizikokimia dan farmaseutikal insulin 15

4. Persediaan insulin 24

5. Kaedah pengeluaran, piawaian dan kawalan kualiti persediaan insulin 31

6. Penggunaan HPLC dalam analisis farmaseutikal insulin. 46

BAB 2. Penyata Masalah 50

BAB 3. Kajian mengenai pengaruh pelbagai faktor pada tingkah laku kromatografi insulin di bawah syarat RP HPLC 56

1. Kaedah dan bahan 57

2. Perbincangan hasil 62

2.1. Pengaruh komposisi penyelesaian penampan 62

2.2. Kesan kepekatan natrium sulfat 68

2.3. Kesan suhu lajur kromatografi 70

2.4. Kesan Pemodulat Organik 75

2.5. Pengaruh panjang radikal alkil fasa dicantumkan 80

2.6. Pengaruh panjang lajur kromatografi 80

BAB 4. Memperbaiki kaedah farmakopoeial untuk menganalisis persediaan insulin berdasarkan penggunaan RP HPLC 82

1. Pemilihan keadaan optimum untuk penentuan kromatografi insulin dan kekotoran dalam persediaan perubatan 82

2. Ciri-ciri metrologi kaedah 84

3. Pemakaian metodologi yang telah dibangunkan untuk ujian persiapan insulin rasmi 95

BAB 5. Pengembangan kaedah untuk analisis bentuk dos suntikan isophane-insulin berdasarkan kaedah PF HPLC

1. Pemilihan syarat untuk penentuan kromatografi protin dalam bentuk dos isophane-insulin 110

2. Kajian profil kromatografi protin yang diasingkan daripada pelbagai spesies ikan 121

3. Kaedah penentuan protamin dalam persediaan isophane-insulin 123

4. Pengesahan metodologi yang telah dibangunkan 125

Kesimpulan umum 136

Rujukan 139

Ciri-ciri umum ciri-ciri fizikokimia dan farmaseutikal insulin

Dari sudut pandangan kimia, insulin adalah protein globular kecil dengan berat molekul sehingga 6000 Da. Pada masa yang sama, perlu dicatat bahawa insulin adalah nama umum untuk seluruh keluarga protein homolog buatan asal dan tiruan dengan aktiviti biologi ciri umum. Sifat protein insulin telah ditubuhkan pada tahun 1928 [52]. Ia adalah antara protein yang menghasilkan reaksi biuret dan reaksi Pauli. Struktur insulin telah ditubuhkan sepenuhnya pada awal 50-an. Komposisi kimia asas insulina dari pelbagai asal dicirikan oleh angka-angka yang diberikan dalam jadual 1 [40].

Komposisi asid amino. Sebilangan besar molekul insulin mengandungi 51 residu asid amino, di antaranya ialah 17 asid amino yang terdapat dalam protein yang paling dikenali.

Ciri ciri komposisi asid amino lembu, babi dan insulin manusia adalah tryptophan dan metionin. Komposisi asid amino jenis insulin ini ditunjukkan dalam jadual 2 [40,46].

Invarian terhadap semua jenis insulin adalah kandungan cystine (6 sisa separuh cystine). Di samping itu, molekul insulin semua jenis mengandungi 6 kumpulan amide (asparagine, glutamine).

Apabila insulin dilepaskan, bersama-sama dengan pecahan utama, pecahan bentuk deamidated insulin dapat diperhatikan. Dalam persekitaran berasid, dalam proses deamidation, kesemua 6 kumpulan amide boleh beransur-ansur berpecah, dan mobiliti electrophoretic dan chromatographic perubahan insulin [40]. Pembentukan bentuk insulin deamidated boleh dinilai oleh keputusan penentuan ammonia. Untuk bentuk insulin penuh amida, 6 mol ammonia setiap 1 mol protein ditentukan, untuk bentuk deamidated, nilai ini mungkin dari 5 hingga 0.

Struktur utama insulin. Struktur utama insulin telah diuraikan oleh kumpulan Sanger pada tahun 1945-1955. Menggunakan beberapa kaedah kromatografi yang memungkinkan untuk memisahkan dan mengenal pasti pelbagai peptida, asid amino dan derivatifnya, Sanger dapat menetapkan struktur utama insulin biji [130,131,132,133,134,135]. Kajian lanjut insulin asal-usul yang berbeza dengan menggunakan pelbagai kaedah fiziko-kimia, termasuk kaedah Edman untuk menentukan keseluruhan urutan asid amino peptida panjang mengesahkan penemuan struktur Senger et al insulin [bb].

Sehingga kini, struktur utama insulin telah ditentukan dalam perwakilan 24 spesis milik 4 kelas haiwan: mamalia, burung, ikan, dan cyclostomes [14]. Penyelidikan mengenai insulin pelbagai asal berlanjutan [71,72,73].

Struktur insulin dalam haiwan yang berbeza adalah serupa, tetapi tidak sama. Dalam struktur utamanya, insulin manusia sama dengan babi, anjing, ikan paus sperma dan insulin kelinci, berbeza hanya dalam satu asid amino [40]. Ia berbeza daripada insulin lembu oleh tiga asid amino. Ke tahap yang lebih tinggi, insulin manusia tidak sama dengan insulin babi, burung dan ikan Guinean [40]. Perbezaan dalam urutan asid amino insulin manusia, babi, dan lembu ditunjukkan dalam Jadual 3.

Walaupun terdapat perbezaan struktur, semua jenis insulin mempunyai aktiviti biologi yang sama, iaitu menyebabkan kesan hipoglikemik. Walau bagaimanapun, magnitud aktiviti biologi yang dipaparkan sangat bergantung kepada spesies dan berada dalam lingkungan 11 IU / mg (insulin cod dari Laut Utara) hingga 62 IU / mg (insulin ayam belanda dan ayam), manakala aktiviti insulin manusia adalah kira-kira 25-30 IU / mg [40]. Semakin besar perbezaan interspisies, semakin besar perbezaan dalam aktiviti biologi insulin sepadan.

Molekul insulin aktif berfungsi terdiri daripada dua rantai polipeptida (rantai A dan B) yang dikaitkan dengan ikatan disulfida; satu ikatan dibentuk oleh sisa-sisa asid amino ketujuh bagi kedua-dua rantai tersebut, ikatan disulfida kedua dibentuk oleh residu ke-20 rantaian A dan sisa ke-19 rantaian B (Rajah 2). Di samping itu, terdapat ikatan disulfida ketiga dalam molekul insulin, iaitu intrachain dan menghubungkan residu rantaian A dan ke-11 [59,117].

Struktur sekunder Menggunakan pelbagai kaedah penyelidikan fizikokimia dan fizikal, ia menunjukkan bahawa molekul insulin mempunyai struktur ruang yang sangat diperintahkan (pengesahan), yang menyumbang kepada pelaksanaan fungsi biologi tertentu [14]. Dalam molekul insulin asli, kedua-dua helaian cc-helix dan p-fold hadir pada masa yang sama. Di samping itu, terdapat kawasan yang mempunyai struktur dan struktur yang tidak teratur <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Apabila larutan berasid insulin (pH 2.3-2.5) dipanaskan pada suhu +100 ° C dan disejukkan dengan cepat kepada -80 ° C, apa yang dipanggil insulin fibrillar terbentuk - bentuk hormon yang tidak aktif sepenuhnya [27]. Pengenalan gentian insulin gentian ke dalam larutan insulin aktif menyebabkan pemendakan kuantitatif secara spontan insulin dalam bentuk fibril [14,17].

Kaedah pengeluaran, piawaian dan kawalan kualiti persediaan insulin

Mendapatkan spesies insulin haiwan. Pengeluaran industri daging lembu dan daging babi insulin telah ditubuhkan hampir serentak di beberapa negara, tidak lama selepas penemuan insulin pada tahun 1921 [63]. Sejak itu, konsep mendapatkan insulin kekal hampir tidak berubah (jadual b) [17, 18]. Bahan mentah untuk pengeluaran spesis insulin haiwan adalah pankreas lembu penyembelih yang digunakan untuk makanan.

Tugas yang paling penting dalam pengeluaran insulin ialah pemurniannya - pelepasan bahan dari kekotoran yang berkaitan, yang mengurangkan aktiviti biologi, menyebabkan tindak balas imunologi, atau berpotensi membahayakan kesihatan pesakit. Contohnya, selepas beberapa tahun menggunakan insulin yang kurang bersih dalam darah pesakit, mungkin ada 5,000 IU insulin terikat kepada antibodi. Antibodi untuk insulin memberi kesan yang ketara kepada profil tindakannya dan, dengan itu, menyumbang kepada kursus labil diabetes.

Kaedah penyucian insulin pertama adalah penghabluran semula dengan kehadiran garam seng. Pada tahun 1945, ia telah menunjukkan bahawa penyulingan semula tujuh kali ganda insulin dengan ketara mengurangkan tahap tindak balas alahan pada pesakit, berbanding dengan persediaan insulin rasmi pada masa itu [63].

pengekstrakan berlawanan (PE), kromatografi partition (PX), pertukaran ion kromatografi (IOC) diskelek-troforeza (DEF), dan gel pengecualian kromatografi (GEH) [63] dengan menggunakan beberapa sampel insulin kaedah Kepelbagaian selepas penghabluran dan rancangan penghabluran tunggal.

Ia telah mendapati bahawa kekotoran utama adalah insulin seiring: proinsulin, perantaraan yang, dimer insulin kovalen, monodezamidoinsulin dan monoarginin monoetilinsulin, serta beberapa sebatian tinggi molekul tidak insulin semula jadi. kesimpulan umum daripada kajian, dengan mengambil maklumat akaun mengenai aktiviti imunologi dikesan kekotoran [138], kesimpulan adalah keperluan untuk pembersihan tambahan bahan insulin, supaya kaedah analisis dan DEF GEH mengesan satu komponen - insulin yang sepadan.

Untuk menyelesaikan masalah pemurnian insulin pada tahun 1950, kaedah HEC dicadangkan, dan pada tahun 1970, kaedah kromatografi pertukaran anion (AOX). Telah didapati bahawa insulin, yang disucikan oleh kaedah AOX, mengandungi kira-kira 500 ppm (bahagian per juta) kekotoran dengan aktiviti proinsulin [137]. Pemurnian tambahan insulin menggunakan kromatografi cecair tekanan tinggi pada fasa terbalik (RP HPLC) mengurangkan kandungan pecahan imunogenik kepada had pengesanan mereka [63].

Kajian semula perkembangan semasa dalam bidang pemurnian kromatografi insulin dibentangkan dalam [96]. Insulin, disucikan, berturut-turut, menggunakan IOC dan GEC, dipanggil insulin monokomponen [63]. Mendapatkan insulin manusia. Pencarian kaedah untuk mendapatkan insulin manusia adalah disebabkan oleh dua keadaan. Di satu pihak, masalah bahan mentah yang mendesak dalam hal pengeluaran insulin haiwan, sebaliknya, perkembangan sains yang pesat di kawasan ini memberikan peluang yang nyata untuk membawa ide kehidupan. Pada tahun 1979 dan 1981 hampir serentak, dua kaedah untuk mendapatkan insulin manusia telah dibangunkan - biosynthetic dan semi sintetik [102,108]. Pada tahun 1981, syarikat Novo Nordisk buat kali pertama di dunia memulakan pengeluaran siri insulin separuh sintetik manusia. Kaedah yang digunakan oleh syarikat adalah berdasarkan penggantian enzimatik dan kimia Al dalam molekul insulin porcine dengan baki Tre [61]. Kaedah ini secara langsung bergantung kepada mendapatkan jumlah insulin poros yang diperlukan, yang mengurangkan nilai ekonominya. Kemungkinan mendapatkan insulin manusia melalui kaedah biosintetik muncul dengan perkembangan teknologi DNA rekombinan [10]. Kerja-kerja pengeluaran insulin genetik bermula sekitar 25 tahun yang lalu. Pada tahun 1978, dilaporkan bahawa ketegangan E. coli menghasilkan tikus proinsou-ling diperolehi. Pada tahun 1979, kajian Genentech dapat mengklonkan E. coli gen-gen pengekodan urutan asid amino untuk. rantai insulin A dan B termasuk di r-poko-tacidase di plasmid pBR322 [10,102]. Pada tahun 1981 ia telah disintesis proinsulin gen analog - mini-proinsulin-C, di mana 35 kolitis segmen C-peptida digantikan dengan enam asid amino: arg-arg-Gly-ser-lys-arg dan menunjukkan rasa terhadap E.coli. Pada tahun 1982, syarikat Eli Lilly memulakan pengeluaran perindustrian insulin manusia pertama di dunia menggunakan dua teknologi rangkaian yang dibangunkan dengan kerjasama Genentech [102]. Pada masa ini, kemungkinan mendapatkan insulin manusia dengan bantuan pelbagai sistem ekspresi telah ditunjukkan [3,10,101,102]. Dari sudut pandangan ekonomi, penggunaan strain E.coli bakteria gram positif yang diubahsuai secara genetik, kebanyakannya dianggap terlalu berlebihan, mempunyai minat khusus [3]. Pada masa yang sama, kemajuan penting dicapai dengan sel-sel yis Saccharomices cerevisiae [3.75]. Jadual 7 menyenaraikan utama, biasa dengan pelbagai kaedah menghasilkan insulin manusia rekombinan, tahap proses teknologi [3,10,63].

Penggunaan metodologi yang telah dibangunkan untuk ujian persediaan insulin rasmi

Tekanan tinggi Chromatography Liquid (HPLC) - Variant lajur kromatografi cecair, di mana fasa bergerak - eluent - mengisi ruang melalui sorbent pada kelajuan yang tinggi kerana tekanan yang besar (sehingga 400h105 Pa) pada kemasukan tiang [11].

Sebagai cara untuk menganalisis campuran bahan yang kompleks, HPLC muncul sedikit lebih dari 30 tahun yang lalu. Penggunaan sorben dengan diameter zarah 3-10 μm menyebabkan peningkatan ketara dalam kecekapan pemisahan kromatografi berbanding dengan versi klasik kromatografi cecair lajur. Oleh itu, HPLC sering dirujuk sebagai kromatografi cair prestasi tinggi (HPLC). Ciri-ciri penting penggunaan HPLC dijelaskan secara terperinci dalam banyak manual [49.50] dan di bahagian yang relevan dari farmakope terkemuka [79.150]. Pelbagai sorben telah dibangunkan dan tersedia untuk HPLC. Menurut penulis tinjauan [51] - kira-kira 100 firma di seluruh dunia menghasilkan lebih daripada 300 jenis nama sorben. Sejarah, keadaan semasa dan prospek untuk pembangunan kaedah dibincangkan dalam ulasan [51] dan [77.78].

Dalam pelbagai variannya, kaedah HPLC digunakan secara meluas dalam analisis farmaseutikal (kawalan pengeluaran dan pengujian kualiti ubat). Kaedah ini dimasukkan ke dalam semua farmakopoei terkemuka di dunia. Kaedah ini paling digambarkan dalam Pharmacopoeias Eropah dan Amerika. HPLC digunakan untuk mengenal pasti ubat, untuk menentukan ketulenan, komposisi pecahan berat molekul dan analisis kuantitatif. Di Amerika Syarikat Pharmacopoeia 28 ed. kira-kira 30% artikel peribadi melibatkan penggunaan HPLC. Di Eropah Pharmacopeia ed. angka ini adalah kira-kira 40%.

Kaedah kromatografi pertama untuk ujian insulin ialah kromatografi cecair pengecutan gel tekanan rendah (GE ZhND). Prinsip pemisahan di bawah syarat-syarat HPLC adalah berdasarkan keupayaan molekul yang berbeza dengan saiz yang berbeza untuk menembusi liang gel neutral, yang berfungsi sebagai fasa pegun. Diameter hidrodinamik monomer dan dimer insulin adalah berkadar dengan berat molekul mereka dan masing-masing adalah 2.69 dan 5.50 nm [115].

Pada tahun 1967, menggunakan kaedah GE-IHDD, ditunjukkan bahawa persediaan komersial insulin, disucikan oleh penghabluran, mengandungi kekotoran dengan berat molekul melebihi berat molekul insulin [63]. Pada kromatograms insulin porcine, tiga puncak dijumpai, secara konvensional ditetapkan sebagai komponen a, b dan c. Sejak itu, beberapa sistem kromatografi telah dicadangkan untuk mengawal kandungan kekotoran berat molekul tinggi dalam persediaan insulin. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan bungkus agarose xerogels (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Atau dextran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), larutan asid asetik 1-3 M digunakan sebagai IF [127]. Kepekaan yang tinggi terhadap sorben ini untuk mampatan pada tekanan yang melebihi tekanan bengkak matriks menjadikan bahan-bahan ini tidak sesuai untuk operasi dalam mod HPLC.

Penggunaan kromatografi cecair pengecualian gel pada tekanan tinggi (GE HPLC) untuk analisis insulin telah dijelaskan dahulu pada tahun 1980, selepas pembangunan keras sorben keras yang serasi dengan air dan menahan tekanan tinggi. Dalam [151], pemisahan dilakukan pada kolum Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) di bawah keadaan penentuan (gabungan larutan 7 urea, asid mineral dan bukan ionik detergen). Keperluan untuk analisis insulin di bawah keadaan penentuan adalah berkaitan dengan keupayaan insulin untuk agregat dalam larutan. Bagi pemisahan insulin di bawah keadaan HPLC HPLC, penggunaan asid asetik larut "tradisional" juga telah diterangkan [152]. Penggunaan asid asetik mempunyai beberapa kelebihan - kesan minimum terhadap struktur asli dari senyawa yang dipisahkan, ketersediaan, kos rendah, sebagai tambahan, fakta penting ialah keupayaan asid asetik untuk menindas persatuan insulin.

Pada masa ini, HPLC ghvd adalah kaedah farmakopoeial untuk memantau kandungan kekotoran berat molekul yang tinggi dalam bahan-bahan dan bentuk dos selesai. Kaedah ini juga digunakan untuk menentukan kandungan protin dalam persediaan isophane-insulin.

Penggunaan HPLC pada fasa terbalik (HP HPLC) untuk pemisahan lembu dan insulin porcine buat kali pertama menunjukkan kecekapan tinggi kaedah ini untuk analisis peptida seperti insulin dengan struktur yang serupa.

Mekanisme pemisahan protein dan polipeptida di bawah syarat-syarat RP HPLC adalah berdasarkan kepada hidrofobisiti berbeza molekul insulin dan kekotoran yang berkaitan. Sehingga kini, beberapa berpuluh-puluh kaedah untuk pemisahan kromatografi insulin dari pelbagai asal dan derivatif mereka, termasuk proin-sulin, polipeptida pankreas, derivatif dezamido, dimer insulin, telah diterangkan. [126] menunjukkan kemungkinan memisahkan insulin ayam, arnab, biri-biri dan kuda. Manusia, daging lembu dan insulin babi juga dipisahkan. Lloyd dan Corran menerbitkan satu cara untuk memisahkan daging lembu, daging babi, insulina manusia dan bentuk-bentuk yang disifatkan sesuai [104].

Pemisahan dijalankan pada sorben gel silika yang diubahsuai, metil, butil, oktil, oktadekil dan kumpulan fenil dalam mod isocratic atau kecerunan. Sebagai PF, pengubah organik digunakan - asetonitril, metil alkohol, isopropil alkohol, bercampur dengan larutan penampung berair yang mengandungi garam anorganik dan reagen ion-wap. Pengesanan puncak dijalankan terutamanya oleh kaedah spektrofotometri pada panjang gelombang 190-220 nm, kaedah fluorimetrik juga diterangkan [103].

Analisis bahan dan bentuk dos insulin yang telah selesai menggunakan RP HPLC dijelaskan dalam artikel peribadi di Amerika dan Eropah Pharmacopoeia [79.150]. Kaedah ini digunakan untuk menguji dadah kumpulan tertentu dari segi "Keaslian Insulin", "Protein Terkait", "Penentuan Kuantitatif" dan "Insulin dalam Penyelesaian".

Sastera penyelidikan juga menerangkan penggunaan kromatografi pertukaran dan ion pertindihan untuk analisis insulin [44,102], namun kaedah-kaedah ini tidak digunakan secara meluas dalam amalan farmakopoeial.

Pilihan keadaan untuk penentuan kromatografi protinine dalam bentuk dos isophane-insulin

Peningkatan kekuatan ion PF biasanya membawa kepada peningkatan nisbah kapasiti insulin, yang boleh disebabkan oleh beberapa faktor: - Meningkatkan kepekatan ion mengurangkan tahap pengionan kumpulan yang dikenakan protein molekul, meningkatkan hidrofobiknya / - kepekatan tinggi kation menyumbang kepada penapisan kumpulan silanol bebas pada permukaan pegun satu fasa yang melemahkan interaksi elektrostatik yang tidak spesifik kumpulan-kumpulan amino protonasi protein dengan matriks; - Kekuatan ionik yang tinggi memberi kesan kepada struktur ruang insulin, hasilnya permukaan yang tersedia untuk berinteraksi dengan perubahan sorben. Kepekatan garam anorganik dalam FS memberi kesan kepada bentuk puncak dan pemilihan pemisahan insulin dan desamido-Asn-insulin [143,144]. Dengan elusi isokumen pada LiChrosorb Sust sorbent dengan larutan 0.1 M natrium fosfat (pH 2.3), hasil yang memuaskan dicapai hanya apabila natrium sulfat ditambah kepada larutan penampan kepada kepekatan 0.1 M. Kaedah analisis kebanyakan insulin termasuk dalam artikel farmakopoeial dan ND, gunakan PF berdasarkan penyelesaian penampan dengan kandungan natrium sulfat bersamaan dengan 0.2 M. Kandungan kandungan natrium sulfat yang tinggi akan menjejaskan kebolehulangan hasil kromatografi kerana stratifikasi eluen, lebih-lebih lagi, Penyelesaian garam yang sangat tertumpu mempunyai kesan negatif ke atas peralatan kromatografi, memendekkan hayat perkhidmatannya. Memandangkan kaedah analisis farmakopoeial telah dibangunkan lebih dari 20 tahun yang lalu, nampaknya menarik untuk mengkaji tingkah laku kromatografi insulin di bawah OF-HPLC pada sorben kromatografi generasi terkini bergantung kepada kepekatan natrium sulfat. Pada masa yang sama, mereka cuba untuk mengetahui sama ada pengurangan kandungan natrium sulfat dalam PF adalah dibenarkan tanpa kemerosotan yang ketara dalam keupayaan pemisahan sistem kromatografi. Hasil daripada penyelidikan itu didapati bahawa kesan kepekatan natrium sulfat dalam PF adalah berbeza, bergantung pada jenis fasa dicantumkan, dan juga pada spesies insulin. Pada sorben dengan kumpulan yang dicantumkan C4 dan C pemilihan pemisahan puncak insulin manusia dan desamido-Asn-insulin manusia tidak bergantung kepada kepekatan natrium sulfat di. penyelesaian buffer1 dalam julat dari 0.05 M hingga 0.2 M. Pada Diaspher-110-C18 sorbent, pemilihan pasangan pemisahan ini mempunyai maksimum pada 0.05 M dan minimum pada 0.1 M (carta 4). Di sisi lain, pemilihan pemisahan spesis insulin haiwan dan bentuk asnA21 yang sesuai desamidated tidak bergantung kepada kekuatan ionik penyelesaian apabila ia dipisahkan di Diasphere-110-C18 sorben. Pada sorben dengan kumpulan C8 dicelup, selektiviti meningkat dari 1.25 hingga 1.28 dengan peningkatan kepekatan natrium sulfat (angka 4). Pada sorben dengan kumpulan C4 yang dicantumkan, pemilihan pemisahan dalam kes insulin daging lembu adalah maksimum pada 0.1 M natrium sulfat dan minimum pada 0.2 M. Bagi insulin daging babi, tiada ketinggian maksimum pada kepekatan natrium sulfat 0.1 M, dalam kes ini peningkatan dalam ionik tentera membawa kepada pengurangan pemilihan pemisahan (angka 4). Bilangan plat teori yang berkesan meningkat dengan peningkatan kepekatan natrium sulfat. Pengecualian adalah tingkah laku insulin manusia terhadap penyinaran Diasfer-110-C8 (angka 5). Tahap pemisahan puncak insulin dan desamido-Asn-insulin meningkat dengan peningkatan kekuatan ion FS, tidak kira spesies insulin dan jenis fasa dicantumkan (gambar b). Dengan mengurangkan kepekatan natrium sulfat dari 0.2 M hingga 0.1 M, tahap pemisahan pasangan puncak terpilih berkurangan secara purata sebanyak 5% untuk insulin manusia dan porcine, dan sebanyak 10% untuk insulin daging lembu. Memandangkan fakta bahawa nilai mutlak tahap pemisahan melebihi 2.0, kemerosotan yang diukur dalam kapasiti pemisahan lajur, pada pendapat kami, tidak ketara. Oleh itu, kepekatan natrium sulfat dalam larutan penampan PF dapat dikurangkan sebanyak 2 kali berbanding dengan kaedah analisis farmakopoeial.

Dalam kebanyakan kajian mengenai analisis protein dan peptida, pemisahan itu dilakukan pada suhu bilik. Tambahan pula, sesetengah penulis menunjukkan bahawa kesan suhu pada pemilihan pemisahan adalah minimum [48]. Walau bagaimanapun, apabila suhu meningkat, proses pertukaran jisim di antara fasa pegun dan mudah alih dipercepatkan, yang menyebabkan penurunan dalam masa pengekalan peptida dan penyempitan puncak.

Insulin diseragamkan oleh

Pankreas adalah salah satu organ yang paling penting dengan rembesan ganda - dalaman dan luaran.
Produk sekresi dalaman adalah insulin, yang memainkan peranan penting dalam metabolisme karbohidrat. Insulin adalah produk sejenis sel khusus yang dikelompokkan ke "pulau" yang disebut Langerhans.

Rahsia luar adalah jus pankreas yang mengandungi trypsin - salah satu enzim pencernaan yang paling penting, yang disembur oleh kelenjar yang membentuk jisim utama pankreas. Trypsin adalah bahagian utama penyediaan pancreatin.
Insulin (Insulinum). Insulin telah terisolasi dalam bentuk tulennya pada tahun 1921. Terdapat banyak kaedah untuk pembuatannya, mereka berbeza dari satu sama lain hanya secara terperinci.

Disebabkan fakta bahawa, sebagai tambahan kepada insulin, enzim trypsin terkandung dalam pankreas, yang memecahkan insulin dengan mudah, percubaan pertama untuk mendapatkan insulin dari pankreas gagal. Oleh itu, kita cuba mendapatkannya dari kelenjar yang mana enzim ini tidak hadir, contohnya, dari kelenjar ikan atau betis intrauterin. Tetapi usaha-usaha ini dalam kejayaan pengeluaran tidak ada, kerana dalam ukuran ikan kelenjar sangat kecil dan perkumuhan kelenjar itu sendiri secara teknis sukar dilaksanakan; pengekstrakan kelenjar dari anak lembu intrauterin dalam kuantiti yang besar untuk pengeluaran memberikan kesukaran yang besar.
Akhirnya, pada tahun 1922, eksperimen dengan kelenjar lembu yang matang menunjukkan bahawa apabila menggunakan alkohol kuat yang berasid, enzim (trypsin, dan sebagainya) tidak diaktifkan dan kehilangan keupayaan untuk memusnahkan insulin.

Skim teknologi pengeluaran. Untuk pengeluaran insulin digunakan pankreas beku atau segar terutamanya dari lembu dan babi.
Mencarik. Untuk mengelakkan pemusnahan hormon dengan trypsin, kelenjar segar tidak lewat daripada 30 minit selepas penyembelihan haiwan itu harus dibersihkan dari tisu bersebelahan, dihancurkan dalam penambang daging.

Pengekstrakan Kelenjar hancur dituangkan dengan alkohol 95%, berasid dengan asid sulfurik (1 bahagian kelenjar adalah 1.5 bahagian alkohol 95 ° tanpa aldehida + 0.5% asid sulfurik atau hidroklorik). Campuran diekstrak dengan penyejukan selama 1.5 jam, kacau sentiasa.
Ekstrak pertama disalirkan, residu tersebut telah hancur atau disentri. Pengekstrakan sekali lagi diekstraksi dengan 1 jam 60 ° alkohol (dan tidak 95 °, kerana tidak ada kelembapan dalam bahan mentah) - satu bahagian kelenjar mengambil satu bahagian alkohol. Kedua-dua ekstrak itu disalirkan bersama dan ditapis melalui satu helai.

Pemecatan protein balast. Daripada ekstrak yang diperolehi, protein dikeluarkan dalam pelbagai cara:
1) dengan menetap di dalam sejuk (dari -4 hingga 0 ° C) dalam masa 48 jam.
2) tambah larutan natrium hidroksida ke ekstrak ke pH 6.6 - 6.8 (dalam sesetengah kes - kepada pH = 6.4 - 6.6).

Pemendakan dipisahkan dengan menggunakan sentrifuge, penapisan atau pemendapan.
Penyejatan dan degreasing. Cecair jernih yang dihasilkan diasaskan dengan asid sulfurik tulen kepada pH = 2.5 dan tertakluk kepada penyejatan kepada 1/10 daripada jumlah pada suhu tidak lebih tinggi daripada 40 ° C.
Selepas mengeluarkan semua alkohol, cecair degreased.

Salting dan pembersihan. Ammonium sulfate ditambah kepada filtrat yang tidak bertetangan kepada tepu, selepas itu insulin dengan sedikit bahan ballast muncul, membentuk kerak mentah insulin, yang dikeluarkan dan dikeringkan, dan kemudian degreased dengan campuran alkohol-eter.
Insulin yang tidak berfungsi dikeringkan di bawah keadaan ambien dan tanah menjadi serbuk. Serbuk efflorescence tertakluk kepada pembersihan selanjutnya untuk mendapatkan insulin kristal yang mengandungi sekurang-kurangnya 22 U dalam 1 mg.
Standardisasi. Insulin yang dihasilkan adalah serbuk putih atau sedikit abu-abu. Ia larut dalam air dan dalam larutan alkohol sehingga 80 °, tetapi tidak larut dalam alkohol dengan kubu melebihi 90 °. Apabila insulin dibubarkan di dalam air, sama ada cecair tidak berwarna atau sedikit kekuningan diperolehi.

Untuk pemeliharaan, 0.3% tricresol atau phenol ditambah kepada penyelesaian dan tertakluk kepada piawaian biologi. Apabila insulin disuntik ke dalam arnab, kandungan karbohidrat mereka dalam darah dari 1.5-5 h akan berkurangan secara purata sebanyak 50%, iaitu dari 0.09 hingga 0.045% (lihat Pharmacopoeia, edisi ke-9). Dosis yang sama dipanggil satu unit arnab, yang sama dengan tiga manusia atau tiga klinikal.
Pembungkusan Penyelesaiannya disalurkan melalui penapis bakteria. Kemudian salur dituangkan dalam keadaan aseptik ke dalam botol 5 atau 10 ml dalam setiap mililiter penyelesaian insulin harus mengandungi 40 atau 80 U.

Botol ditutup dengan penutup getah yang digulung dengan topi aluminium.
Label diletakkan pada botol dan di dalam kotak dengan botol, di mana aktiviti penyediaan, tarikh pembuatan, jangka hayat, dan lain-lain harus ditunjukkan.

Sebelum menggunakan insulin, topi aluminium dibuka, disapu dengan alkohol, maka gabus disempit dengan jarum steril dan jumlah cecair yang diperlukan disedut ke dalam jarum suntikan, yang disuntik subcutaneously atau intramuscularly.
Penyimpanan Insulin disimpan dalam botol. Hayat rak adalah 18 bulan pada suhu tidak lebih tinggi daripada 10 ° C, kerana pada suhu yang lebih tinggi, insulin mungkin kehilangan sebahagian aktiviti.

Tanda-tanda luar tidak sesuai: kekuningan penyelesaian atau pemendakan, penampilan acuan di dalam vials atau koloni mikroorganisma.

Kumpulan farmakologi - Insulins

Persediaan subkeluar dikecualikan. Dayakan

Penerangan

Insulin (dari Latin. Insula - islet) adalah hormon protein-peptida yang dihasilkan oleh sel-sel β daripada pankreas pulau Langerhans. Di bawah keadaan fisiologi, sel-sel insulin β terbentuk dari preproinsulin, satu protein prekursor rantaian tunggal yang terdiri daripada 110 residu asid amino. Selepas reticulum endoplasma kasar dipindahkan melalui membran, 24 peptida isyarat asid amino dibelah dari preproinsulin dan proinsulin terbentuk. Rantai panjang proinsulin dalam peralatan Golgi dibungkus dalam granul, di mana sebagai akibat daripada hidrolisis empat residu asid amino utama dipecah untuk membentuk insulin dan peptida C-terminal (fungsi fisiologi C-peptida tidak diketahui).

Molekul insulin terdiri daripada dua rantai polipeptida. Salah satunya mengandungi 21 residu asid amino (rantai A), residu asid amino yang kedua - 30 (rantai B). Rantai dihubungkan oleh dua jambatan disulfida. Jambatan disulfida ketiga dibentuk di dalam rantai A. Berat molekul total molekul insulin adalah kira-kira 5700. Urutan asid amino insulin dianggap konservatif. Kebanyakan spesies mempunyai satu insulin yang menggabungkan satu protein. Pengecualian adalah tikus dan tikus (mereka mempunyai dua insulin gen), mereka menghasilkan dua insulin, yang berbeza dalam dua residu asid amino dari rantai B.

Struktur utama insulin dalam pelbagai spesies biologi, termasuk dan dalam mamalia yang berbeza, agak berbeza. Paling hampir dengan struktur insulin manusia ialah insulin porcine, yang berbeza daripada manusia oleh asid amino (ia mempunyai residu alanin dalam rantai B dan bukannya threonine residu asid amino). Insulin lembu berbeza daripada tiga residu asid amino manusia.

Latar belakang sejarah. Pada tahun 1921, Frederick G. Banting dan Charles G. Best, bekerja di makmal John J. R. McLeod di University of Toronto, mengeluarkan ekstrak dari pankreas (yang kemudiannya mengandungi insulin amorf), yang mengurangkan kadar glukosa darah dalam anjing dengan diabetes eksperimen. Pada tahun 1922, ekstrak pankreas disuntik ke pesakit pertama, Leonard Thompson, 14 tahun, yang mempunyai diabetes, dan menyelamatkan nyawanya. Pada tahun 1923, James B. Collip membangunkan kaedah untuk pembersihan ekstrak yang diekstrak dari pankreas, yang kemudiannya membolehkan penyediaan ekstrak aktif dari kelenjar pankreas babi dan lembu, yang menghasilkan hasil yang boleh dihasilkan. Pada tahun 1923, Banting dan McLeod dianugerahkan Hadiah Nobel dalam Fisiologi dan Perubatan untuk penemuan insulin. Pada tahun 1926, J. Abel dan V. Du-Vigno memperoleh insulin dalam bentuk kristal. Pada tahun 1939, insulin pertama kali diluluskan oleh FDA (Pentadbiran Makanan dan Dadah). Frederick Sanger sepenuhnya menguraikan urutan asid amino insulin (1949-1954). Pada tahun 1958, Sanger dianugerahi Hadiah Nobel untuk kerja-kerjanya untuk menguraikan struktur protein, terutama insulin. Pada tahun 1963, insulin buatan telah disintesis. Insulin manusia rekombinan pertama diluluskan oleh FDA pada tahun 1982. Analog insulin ultrashort yang bertindak (insulin lispro) telah diluluskan oleh FDA pada tahun 1996.

Mekanisme tindakan. Dalam melaksanakan kesan insulin, peranan utama dimainkan oleh interaksi dengan reseptor spesifik yang dilokalisasi pada membran plasma sel dan pembentukan kompleks reseptor insulin. Dalam kombinasi dengan reseptor insulin, insulin memasuki sel, di mana ia mempengaruhi fosforilasi protein selular dan mencetuskan pelbagai reaksi intrasel.

Dalam mamalia, reseptor insulin didapati di hampir semua sel, kedua-dua sel sasaran insulin klasik (hepatosit, myosit, liposit), dan sel darah, otak dan kelenjar seks. Bilangan reseptor pada sel yang berbeza adalah dari 40 (eritrosit) hingga 300 ribu (hepatosit dan liposit). Reseptor insulin sentiasa disintesis dan diuraikan, separuh hayatnya adalah 7-12 jam.

Reseptor insulin adalah glikoprotein transmembrane besar yang terdiri daripada dua α-subunit dengan jisim molekul 135 kDa (masing-masing mengandungi 719 atau 731 sisa asid amino bergantung kepada splicing mRNA) dan dua β-subunit dengan jisim molekul 95 kDa (620 amino asid residu). Subunit-subunit itu saling terhubung dengan ikatan disulfida dan membentuk struktur heterotramerik β-α-α-β. Subunit alfa terletak secara extracellularly dan mengandungi laman insulin yang mengikat, sebagai pengiktirafan sebahagian daripada reseptor. Subunit beta membentuk domain transmembrane, mempunyai aktiviti tirosin kinase dan melaksanakan fungsi penukaran isyarat. Pengikatan insulin kepada α-subunit reseptor insulin membawa kepada rangsangan aktiviti kinase tyrosin subunit-β oleh autofosforlasi residu tirosin mereka, pengagregatan α, β-heterodimer dan penyegerakan cepat kompleks reseptor hormon berlaku. Reseptor insulin yang aktif memulakan litar reaksi biokimia, termasuk fosforilasi protein lain dalam sel. Pertama tindak balas ini ialah fosforilasi empat protein, yang dikenali sebagai substrat reseptor insulin (substrat reseptor insulin), IRS-1, IRS-2, IRS-3 dan IRS-4.

Kesan farmakologi insulin. Insulin menjejaskan hampir semua organ dan tisu. Walau bagaimanapun, sasaran utamanya ialah tisu hati, otot dan adipose.

Insulin endogen adalah pengawal selia yang paling penting dalam metabolisme karbohidrat, insulin eksogen adalah ejen pengurangan gula tertentu. Kesan insulin pada metabolisme karbohidrat adalah kerana ia meningkatkan pengangkutan glukosa melalui membran sel dan penggunaannya oleh tisu, menyumbang kepada penukaran glukosa ke dalam glikogen dalam hati. Insulin, sebagai tambahan, menghalang pengeluaran glukosa endogen dengan menekan glycogenolysis (pecahan glikogen ke glukosa) dan gluconeogenesis (sintesis glukosa daripada sumber bukan karbohidrat - contohnya, dari asid amino, asid lemak). Selain hipoglikemik, insulin mempunyai beberapa kesan lain.

Kesan insulin pada metabolisme lemak ditunjukkan dalam penghambatan lipolisis, yang mengakibatkan pengurangan aliran asid lemak bebas ke dalam aliran darah. Insulin menghalang pembentukan badan keton di dalam badan. Insulin meningkatkan sintesis asid lemak dan esterifikasi seterusnya.

Insulin terlibat dalam metabolisme protein: ia meningkatkan pengangkutan asid amino ke seluruh membran sel, merangsang sintesis peptida, mengurangkan penggunaan protein oleh tisu, dan menghalang penukaran asid amino ke dalam keto asam.

Tindakan insulin disertai oleh pengaktifan atau perencatan sejumlah enzim: glycogen synthetase, piruvat dehydrogenase, hexokinase dirangsang, lipase (dan menghidrolisis lipid tisu adiposa, dan lipase lipase, yang mengurangkan kekeruhan serum selepas memakan makanan tinggi lemak) dihalang.

Dalam pengawalan fisiologi biosintesis dan rembesan insulin oleh pankreas, kepekatan glukosa dalam darah memainkan peranan utama: dengan peningkatan kandungannya, rembesan insulin meningkat, dan dengan penurunan ia melambatkan. Rembesan insulin, selain glukosa, dipengaruhi oleh elektrolit (terutama ion Ca 2+), asid amino (termasuk leucine dan arginine), glukagon, somatostatin.

Farmakokinetik. Persediaan insulin disuntik s / c, intramuskular atau intravena (di dalam, hanya insulin bertindak pendek, dan hanya dalam precoma diabetik dan koma). Tidak mustahil untuk masuk dalam / penggantungan insulin. Suhu insulin harus berada pada suhu bilik, kerana insulin sejuk diserap dengan lebih perlahan. Cara yang paling optimum untuk terapi insulin yang berterusan dalam amalan klinikal ialah pengenalan.

Kesempurnaan penyerapan dan permulaan kesan insulin bergantung kepada tapak suntikan (biasanya insulin disuntik ke dalam perut, paha, punggung, lengan atas), dos (jumlah insulin disuntik), kepekatan insulin dalam penyediaan, dan sebagainya.

Kadar penyerapan insulin ke dalam darah dari tapak suntikan bergantung kepada beberapa faktor - seperti insulin, tapak suntikan, kadar aliran darah tempatan, aktiviti otot tempatan, jumlah insulin yang disuntik (tidak lebih daripada 12-16 U ubat disyorkan untuk disuntik ke satu tempat). Paling cepat, insulin memasuki darah dari tisu subkutaneus dinding perut anterior, lebih perlahan dari bahu, permukaan depan paha, dan lebih perlahan dari subscapularis dan punggung. Ini disebabkan oleh tahap vaskularisasi tisu lemak subkutaneus di kawasan yang disenaraikan. Profil tindakan insulin adalah tertakluk kepada turun naik yang signifikan dalam kedua-dua orang yang berlainan dan orang yang sama.

Dalam darah, insulin mengikat alpha dan beta globulin, biasanya 5-25%, tetapi pengikatan boleh meningkat semasa rawatan disebabkan oleh penampilan antibodi serum (penghasilan antibodi untuk insulin eksogen menyebabkan rintangan insulin; dengan penggunaan persediaan yang sangat tulen moden, ketahanan insulin jarang berlaku ). T1/2 darah kurang daripada 10 minit. Kebanyakan insulin yang dikeluarkan ke dalam aliran darah mengalami kerosakan proteolitik dalam hati dan buah pinggang. Ia cepat dikumuhkan oleh buah pinggang (60%) dan hati (40%); kurang daripada 1.5% dikumuhkan dalam urin tidak berubah.

Persediaan insulin yang sedang digunakan berbeza dalam beberapa cara, termasuk dengan sumber asal, tempoh tindakan, larutan pH (berasid dan neutral), kehadiran pengawet (phenol, cresol, phenol-cresol, metil paraben), kepekatan insulin - 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Pengkelasan. Insulina biasanya diklasifikasikan berdasarkan asal (bovine, porcine, manusia, serta analog insulin manusia) dan tempoh tindakan.

Bergantung kepada sumber pengeluaran, insulin asal haiwan (terutamanya persediaan insulin daging babi), persiapan insulin manusia separuh sintetik (diperolehi daripada insulin daging babi oleh transformasi enzimatik), persediaan insulin manusia (rekombinan DNA yang dihasilkan oleh kejuruteraan genetik) dibezakan.

Untuk kegunaan perubatan, insulin sebelumnya diperoleh terutamanya dari pankreas lembu, kemudian dari kelenjar pankreas babi, memandangkan insulin porcine lebih dekat dengan insulin manusia. Sejak insulin lembu, yang berbeza daripada tiga asid amino manusia, sering menyebabkan reaksi alergi, hari ini praktikalnya tidak digunakan. Insulin babi, yang berbeza daripada asid amino manusia, kurang berkemungkinan menyebabkan reaksi alahan. Dalam persediaan ubat insulin, jika terdapat pembersihan yang tidak mencukupi, terdapat kekotoran (proinsulin, glukagon, somatostatin, protein, polipeptida) yang boleh menyebabkan pelbagai reaksi sampingan. Teknologi moden memungkinkan untuk mendapatkan dimurnikan (mono-peak-chromatographically disucikan dengan pelepasan insulin "puncak"), sangat murni (mono-komponen) dan penyediaan insulin crystallized. Daripada persediaan insulin asal haiwan, keutamaan diberikan kepada insulin mono-puncak yang berasal dari pankreas babi. Insulin yang diperolehi oleh kejuruteraan genetik sepenuhnya konsisten dengan komposisi asid amino insulin manusia.

Aktiviti insulin ditentukan oleh kaedah biologi (mengikut keupayaannya untuk menurunkan glukosa darah dalam arnab) atau melalui kaedah fizikokimia (oleh elektroforesis di atas kertas atau oleh kromatografi di atas kertas). Untuk satu unit tindakan, atau unit antarabangsa, ambil satu aktiviti 0.04082 mg daripada insulin kristal. Pankreas manusia mengandungi sehingga 8 mg insulin (kira-kira 200 U).

Persediaan insulin dibahagikan kepada ubat-ubatan pendek dan ultrashort - meniru rembesan fisiologi biasa insulin oleh pankreas sebagai tindak balas kepada rangsangan, dadah ubat jangka panjang dan ubat-ubatan jangka panjang - meniru rembesan insulin basal (latar belakang), serta gabungan ubat-ubatan (menggabungkan kedua-dua tindakan).

Terdapat kumpulan berikut:

Ultrashort-acting insulins (kesan hipoglikemik berkembang 10-20 minit selepas s / c suntikan, puncak tindakan dicapai secara purata selepas 1-3 jam, tempoh tindakan adalah 3-5 jam):

- insulin lispro (Humalog);

- insulin aspart (NovoRapid Penfill, NovoRapid FlexPen);

- insulin glulisine (apidra).

Insulin bertindak pendek (permulaan tindakan biasanya selepas 30-60 minit, maksimum tindakan selepas 2-4 jam, tempoh tindakan sehingga 6-8 jam):

- insulin larut [kejuruteraan genetik manusia] (Actrapid HM, Gensulin R, Rinsulin R, Humulin Regular);

- insulin terlarut [manusia semi sintetik] (Biogulin R, Humodar R);

- insulin larut [monokomponen porcine] (Actrapid MS, Monodar, Monosuinsulin MK).

Persediaan insulin jangka panjang - termasuk ubat-ubatan jangka masa panjang tindakan dan ubat-ubatan lama.

Insulin daripada tempoh tindakan sederhana (bermula selepas 1.5-2 jam; puncak selepas 3-12 jam; tempoh 8-12 jam):

- Insulin-isophane [kejuruteraan genetik manusia] (Biosulin N, Gansulin N, Gensulin N, Insuman Bazal GT, NPH Insuran, Protafan NM, Rinsulin NPH, Humulin NPH);

- insulin-isophane [manusia semi sintetik] (Biogulin N, Humodar B);

- insulin-isophane [monocomponent porcine] (Monodar B, Protafan MS);

- penggantungan senyuman zink insulin (Monotard MS).

Insulin lama bertindak (bermula selepas 4-8 jam, puncak selepas 8-18 jam; tempoh masa 20-30 h):

- insulin glargine (Lantus);

- insulin detemir (Levemir Penfill, Levemir FlexPen).

Persediaan insulin gabungan (persiapan biphasic) (kesan hypoglycemic bermula 30 minit selepas pentadbiran s / c, mencapai maksimum selepas 2-8 jam dan bertahan sehingga 18-20 jam):

- insulin biphasic [manusia semi sintetik] (Biogulin 70/30, Humodar K25);

- insulin biphasic [manusia kejuruteraan genetik] (Gansulin 30P, Gensulin M 30, Insuman Sikat 25 GT, Mikstaard 30 NM, Humulin M3);

- insulin aspart biphasic (Novomix 30 Penfill, Novomix 30 FlexPen).

Ultrashort-acting insulins adalah analog insulin manusia. Adalah diketahui bahawa insulin endogen dalam sel-β-pankreas, serta molekul hormon dalam penyelesaian yang dihasilkan insulin bertindak pendek dipolimerisasi dan heksamer. Apabila pentadbiran s / c pentadbiran hexameric diserap dengan perlahan dan kepekatan puncak hormon dalam darah, sama dengan yang dalam orang yang sihat selepas makan, adalah mustahil untuk membuat. Analog insulin bertindak pendek pertama, yang diserap dari tisu subkutaneus 3 kali lebih cepat daripada insulin manusia, adalah insulin lispro. Insulin lispro adalah derivatif insulin manusia yang diperolehi dengan menukar dua residu asid amino dalam molekul insulin (lisin dan proline pada kedudukan 28 dan 29 dari rantai B). Pengubahsuaian molekul insulin mengganggu pembentukan hexamers dan memberikan aliran cepat dadah ke dalam darah. Hampir sejurus selepas suntikan s / c di dalam tisu, molekul insulin lispro dalam bentuk hexamer dengan cepat memisahkan monomer dan memasuki darah. Satu lagi insulin analog - insulin aspart - dicipta dengan menggantikan proline pada posisi B28 dengan asid aspartic yang dicas yang negatif. Seperti insulin lispro, selepas suntikan sc, ia juga cepat merosot ke dalam monomer. Dalam glulinin insulin, penggantian insulin manusia asparagin asin amino pada kedudukan B3 untuk lisin dan lisin pada kedudukan B29 untuk asid glutamat juga menyumbang kepada penyerapan yang lebih cepat. Ultrashort yang bertindak analog insulin boleh diberikan segera sebelum makan atau selepas makan.

Insulin bertindak pendek (juga dikenali sebagai larut) adalah penyelesaian dalam penampan dengan nilai pH neutral (6.6-8.0). Mereka bertujuan untuk subkutaneus, kurang kerap - pentadbiran intramuskular. Sekiranya perlu, mereka juga diberikan secara intravena. Mereka mempunyai kesan hipoglikemik yang cepat dan relatif singkat. Kesan selepas suntikan subkutaneus berlaku selepas 15-20 min, mencapai maksimum selepas 2 jam; jumlah tempoh tindakan adalah kira-kira 6 jam. Mereka digunakan terutamanya di hospital semasa penubuhan dos insulin yang diperlukan untuk pesakit, dan juga apabila kesan cepat (mendesak) diperlukan - dalam koma dan precoma diabetik. Dengan / dalam pengenalan T1/2 menjadikan 5 minit, oleh itu pada insulin koma ketoacidotic diabetik ditadbir dalam / dalam titisan. Persediaan insulin bertindak pendek juga digunakan sebagai agen anabolik dan ditetapkan, sebagai peraturan, dalam dos kecil (4-8 IU 1-2 kali sehari).

Insulin daripada jangka sederhana tindakan kurang larut, mereka lebih perlahan diserap dari tisu subkutaneus, akibatnya mereka mempunyai kesan yang lebih panjang. Tindakan berpanjangan ubat-ubatan ini dicapai dengan adanya prolongator khusus - protamin (isophane, protaphan, basal) atau zink. Kelembapan penyerapan insulin dalam persiapan yang mengandungi penggantungan senyuman zink insulin, disebabkan adanya kristal zink. Insulin NPH-insulin (neutral protamine Hagedorn, atau isophane) adalah penggantungan yang terdiri daripada insulin dan protamin (protamin adalah protein yang diasingkan dari susu ikan) dalam nisbah stoikiometrik.

Insulin lama bertindak termasuk insulin glargine - analog insulin manusia, yang diperolehi oleh teknologi rekombinan DNA - ubat insulin pertama yang tidak mempunyai puncak tindakan yang jelas. Glukoma insulin diperolehi oleh dua modifikasi dalam molekul insulin: menggantikan rantai A (asparagine) dengan glisin pada kedudukan 21 dan melampirkan dua residu arginin ke terminal C-dalam rantai B. Ubat ini adalah penyelesaian yang jelas dengan pH 4. PH berasid menstabilkan hexamers insulin dan menyediakan penyerapan dadah yang panjang dan boleh diramal dari tisu subkutan. Walau bagaimanapun, disebabkan oleh pH berasid, glukol insulin tidak boleh digabungkan dengan insulin bertindak pendek yang mempunyai pH neutral. Satu suntikan glutarin insulin menyediakan kawalan glisemik bukan puncak 24-jam. Kebanyakan persediaan insulin mempunyai apa yang dipanggil. "Puncak" tindakan, diperhatikan apabila kepekatan insulin dalam darah mencapai maksimum. Glukoma insulin tidak mempunyai puncak yang jelas, kerana ia dilepaskan ke dalam aliran darah pada kadar yang relatif tetap.

Persediaan insulin terhadap tindakan yang berpanjangan tersedia dalam pelbagai bentuk dos yang mempunyai kesan hipoglikemik dalam tempoh yang berbeza (dari 10 hingga 36 jam). Kesan yang berpanjangan mengurangkan bilangan suntikan harian. Mereka biasanya dihasilkan dalam bentuk penggantungan, ditadbir hanya subcutaneously atau intramuscularly. Dalam koma diabetik dan keadaan pra-koma, ubat yang berpanjangan tidak digunakan.

Persediaan insulin gabungan adalah penggantungan yang terdiri daripada insulin jangka pendek yang bertindak secara neutral dan insulin-isophane (jangka masa panjang tindakan) dalam nisbah tertentu. Kombinasi insulin ini dalam jangka masa yang berlainan dalam satu persediaan membolehkan pesakit untuk menyelamatkan dua suntikan dengan penggunaan dadah yang berasingan.

Petunjuk. Petunjuk utama untuk penggunaan insulin adalah diabetes mellitus jenis 1, tetapi dalam keadaan tertentu ia juga ditetapkan untuk jenis diabetes mellitus 2, termasuk. dengan ketahanan terhadap agen hipoglikemik mulut, dengan penyakit bersamaan, dalam persiapan untuk campur tangan pembedahan, koma diabetes, dengan diabetes pada wanita hamil. Insulin bertindak pendek tidak hanya digunakan dalam kencing manis, tetapi juga dalam beberapa proses patologi lain, misalnya, keletihan umum (sebagai ejen anabolik), furunculosis, thyrotoxicosis, penyakit perut (atony, gastroptosis), hepatitis kronik, dan bentuk utama sirosis hati serta dalam beberapa penyakit mental (pentadbiran dosis besar insulin - koma hypoglycemic yang dipanggil); ia kadang-kadang digunakan sebagai komponen "polarisasi" penyelesaian yang digunakan untuk merawat kegagalan jantung akut.

Insulin adalah rawatan khusus untuk diabetes mellitus. Rawatan diabetes mellitus dilakukan mengikut skim-skim yang dibangunkan khusus dengan penggunaan persediaan insulin yang berlainan tempoh tindakan. Pemilihan dadah bergantung kepada keparahan dan ciri-ciri penyakit, keadaan umum pesakit dan kelajuan permulaan dan jangka masa tindakan pengurangan gula ubat.

Semua persediaan insulin digunakan tertakluk kepada pematuhan mandatori dengan rejim pemakanan dengan sekatan nilai tenaga makanan (dari 1,700 hingga 3,000 kcal).

Dalam menentukan dos insulin, mereka berpandukan tahap glukosa puasa dan pada siang hari, serta tahap glikosuria pada siang hari. Pemilihan dos akhir dijalankan di bawah kawalan mengurangkan hiperglikemia, glikosuria, serta keadaan umum pesakit.

Contraindications. Insulin dikontraindikasikan dalam penyakit dan keadaan yang berlaku dengan hipoglikemia (contohnya, insulinoma), penyakit akut hati, pankreas, buah pinggang, ulser gastrik dan duodenal, cacat jantung yang decompensated, dalam kekurangan koronari akut dan beberapa penyakit lain.

Gunakan semasa hamil. Rawatan ubat utama untuk diabetes mellitus semasa hamil adalah terapi insulin, yang dijalankan di bawah pengawasan yang rapat. Dalam kes diabetes mellitus jenis 1, rawatan insulin diteruskan. Dalam kes diabetes mellitus jenis 2, ubat hipoglikemik oral dibatalkan dan terapi diet dijalankan.

Gestational diabetes mellitus (diabetes hamil) adalah gangguan metabolisme karbohidrat yang pertama berlaku semasa kehamilan. Diabetis Gestational dikaitkan dengan peningkatan risiko kematian perinatal, kejadian malformasi kongenital, serta risiko perkembangan kencing manis 5-10 tahun selepas bersalin. Rawatan diabetes kencing manis bermula dengan pemakanan. Jika terapi diet tidak berkesan, insulin digunakan.

Bagi pesakit dengan diabetes mellitus yang terdahulu atau yang mengalami masalah gestasi, adalah penting untuk mengekalkan peraturan proses metabolik yang mencukupi sepanjang kehamilan. Keperluan insulin dapat berkurangan pada trimester pertama kehamilan dan peningkatan trimester kedua dan ketiga. Semasa melahirkan anak dan selepas itu, keperluan untuk insulin dapat menurun secara mendadak (risiko peningkatan hipoglikemia). Di bawah keadaan ini, pemantauan teliti glukosa darah adalah penting.

Insulin tidak menembusi halangan plasenta. Walau bagaimanapun, antibodi IgG ibu kepada insulin melalui plasenta dan mungkin menyebabkan hyperglycemia dalam janin dengan meneutralkan insulin yang disembur daripadanya. Sebaliknya, pencabulan kompleks insulin - antibodi boleh menyebabkan hiperinsulinemia dan hipoglikemia dalam janin atau bayi baru lahir. Telah ditunjukkan bahawa peralihan dari persiapan insulin lembu / porcine ke persediaan monokomponen disertai dengan pengurangan titer antibodi. Dalam hal ini, semasa kehamilan, disarankan untuk hanya menggunakan persediaan insulin manusia.

Analog insulin (seperti ejen-ejen yang baru dibangunkan) ditetapkan dengan berhati-hati semasa kehamilan, walaupun tidak ada bukti kesan buruk. Menurut cadangan FDA diiktiraf (Food and Drug Administration), menentukan kemungkinan penggunaan ubat-ubatan semasa mengandung, penyediaan insulin setimpal dengan hasil tindakan dikategorikan sebagai B (kajian pembiakan pada haiwan telah menunjukkan kesan buruk kepada janin, dan kajian yang mencukupi dan yang terkawal di kalangan wanita hamil wanita tidak dijalankan) atau kategori C (kajian pembiakan haiwan menunjukkan kesan buruk pada janin, dan kajian yang mencukupi dan terkawal dalam wanita hamil tidak dijalankan, tetapi Faedah yang berpotensi yang berkaitan dengan penggunaan ubat-ubatan pada wanita hamil boleh membenarkan penggunaannya, walaupun ada risiko yang mungkin). Oleh itu, lizpro insulin tergolong dalam kelas B, dan insulin aspart dan insulin glargine - ke kelas C.

Komplikasi terapi insulin. Hipoglikemia. Pengenalan dosis yang terlalu tinggi, serta kekurangan pengambilan karbohidrat dengan makanan boleh menyebabkan keadaan hypoglycemic yang tidak diingini, koma hipoglikemik dapat berkembang dengan hilangnya kesadaran, kejang dan kemurungan aktiviti jantung. Hipoglikemia juga boleh berlaku kerana tindakan faktor tambahan yang meningkatkan kepekaan insulin (contohnya, kekurangan adrenal, hypopituitarism) atau meningkatkan penyerapan tisu glukosa (senaman).

Tanda-tanda awal hipoglisemia, yang sebahagian besarnya berkaitan dengan pengaktifan sistem saraf simpatetik (gejala adrenergic) termasuk tachycardia, peluh sejuk, menggeletar, dengan pengaktifan sistem parasimpatetik - kelaparan yang kuat, loya dan berdenyut-denyut di bibir dan lidah. Pada tanda pertama hipoglikemia, langkah-langkah segera perlu diambil: pesakit harus minum teh manis atau makan beberapa gumpalan gula. Dalam koma hipoglikemik, larutan glukosa 40% dalam jumlah 20-40 ml atau lebih disuntik ke dalam urat sehingga pesakit meninggalkan keadaan comatose (biasanya tidak melebihi 100 ml). Hipoglisemia juga boleh dikeluarkan oleh glukagon intramuskular atau subkutaneus.

Peningkatan berat badan semasa terapi insulin dikaitkan dengan penghapusan glukosuria, peningkatan kandungan kalori makanan sebenar, peningkatan selera makan dan rangsangan lipogenesis di bawah tindakan insulin. Jika anda mengikuti prinsip pemakanan, kesan sampingan ini boleh dielakkan.

Penggunaan ubat-ubatan hormon moden yang sangat murni (terutamanya persediaan insulin manusia yang direka secara genetik) agak jarang menyebabkan perkembangan rintangan insulin dan alergi, tetapi kes-kes tersebut tidak dikecualikan. Perkembangan reaksi alahan akut memerlukan terapi desensitisasi segera dan penggantian ubat. Apabila membangun reaksi terhadap persediaan insulin lembu / porcine, mereka perlu digantikan dengan persediaan insulin manusia. tindak balas setempat dan sistematik (pruritus, ruam tempatan atau sistemik, pembentukan nodul subkutaneus di tempat suntikan) dikaitkan dengan kesucian insulin yang tidak mencukupi dari kekotoran atau menggunakan bovine atau insulin babi, yang berbeza dalam urutan asid amino dari manusia.

Reaksi alahan yang paling kerap adalah kulit, antibodi IgE-pengantara. Kadangkala, tindak balas alahan sistemik diperhatikan, serta rintangan insulin yang diantarkan oleh antibodi IgG.

Penglihatan kabur Keadaan transient dari pembiasan mata berlaku pada awal permulaan terapi insulin dan hilang sendiri dalam 2-3 minggu.

Edema. Pada minggu pertama terapi, edema kaki sementara juga berlaku kerana pengekalan cecair, apa yang dipanggil. insulin bengkak.

Reaksi tempatan termasuk lipodystrophy di tapak suntikan berulang (komplikasi jarang). Alokasikan lipoatrofi (hilangnya simpanan lemak subkutan) dan lipohipertropi (peningkatan deposisi lemak subkutan). Kedua-dua negara mempunyai sifat yang berbeza. Lipoatrophy - tindak balas imunologi, terutamanya disebabkan oleh pentadbiran persiapan insulin yang tidak dimurnikan dari asal haiwan, kini hampir tidak dijumpai. Lipohypertrophy berkembang dengan menggunakan persediaan insulin manusia yang sangat murni dan mungkin berlaku jika teknik suntikan terganggu (penyediaan sejuk, alkohol mendapat di bawah kulit), dan juga disebabkan oleh tindakan tempatan anabola penyediaan itu sendiri. Lipohypertrophy mencipta kecacatan kosmetik yang menjadi masalah bagi pesakit. Di samping itu, kerana kecacatan ini, penyerapan ubat itu terjejas. Untuk mencegah perkembangan lipohypertrophy, disyorkan untuk sentiasa menukar tapak suntikan dalam kawasan yang sama, meninggalkan sekurang-kurangnya 1 cm di antara dua punca.

Mungkin terdapat tindak balas tempatan seperti kesakitan di tapak pentadbiran.

Interaksi Persediaan insulin boleh digabungkan dengan satu sama lain. Banyak ubat-ubatan boleh menyebabkan hipo- atau hiperglikemia, atau mengubah reaksi pesakit diabetes mellitus kepada rawatan. Anda harus mempertimbangkan interaksi, mungkin dengan penggunaan insulin serentak dengan ubat lain. Penyekat alfa dan beta-adrenomimetiki meningkatkan rembesan insulin endogen dan meningkatkan kesan ubat. kesan hipoglisemik insulin meningkatkan ejen lisan hipoglisemik, salisilat, perencat MAO (termasuk furazolidone, procarbazine, selegiline), perencat ACE, bromocriptine, Octreotide, sulfonamides, steroid anabolik (terutamanya oxandrolone, methandienone) dan androgen (kepekaan meningkat kepada insulin dan meningkatkan rintangan tisu kepada glukagon, yang membawa kepada hipoglikemia, terutamanya dalam kes rintangan insulin; anda mungkin perlu mengurangkan dos insulin), analog somatostatin, guanetidine, dizo piramid, clofibrate, ketoconazole, persediaan litium, Mebendazole, pentamidine, pyridoxine, Propoxyphene, Phenylbutazone, fluoxetine, theophylline, fenfluramine, persediaan litium, kalsium persediaan, tetracyclines. Chloroquine, quinidine, quinine mengurangkan kemerosotan insulin dan dapat meningkatkan kepekatan insulin dalam darah dan meningkatkan risiko hipoglikemia.

Inhibitor carboanhydrase (terutamanya acetazolamide), dengan merangsang sel-sel pancreatic β, menggalakkan pembebasan insulin dan meningkatkan sensitiviti reseptor dan tisu kepada insulin; walaupun penggunaan ubat-ubatan ini secara serentak dengan insulin dapat meningkatkan kesan hipoglikemik, kesannya mungkin tidak dapat diprediksi.

Beberapa ubat menyebabkan hiperglikemia pada orang yang sihat dan memburukkan lagi perjalanan penyakit pada pesakit diabetes. Kesan hipoglikemik insulin lemah: ubat antiretroviral, asparaginase, kontraseptif hormon oral, glucocorticoid, diuretik (thiazide, asid etacrynic), heparin, antagonis H2-reseptor, sulfinpyrazone, antidepresan tricyclic, dobutamine, isoniazid, calcitonin, niacin, sympathomimetics, Danazol, clonidine, CCB, diazoxide, morfin, phenytoin, hormon pertumbuhan, hormon tiroid, derivatif phenothiazine, nikotin, etanol.

Glukokortikoid dan epinefrin mempunyai kesan yang bertentangan dengan insulin pada tisu periferi. Sebagai contoh, penggunaan berpanjangan glucocorticoids boleh menyebabkan hiperglisemia sistemik sehingga diabetes (kencing manis steroid), yang dapat dilihat dalam kira-kira 14% daripada pesakit yang menerima kortikosteroid sistemik dalam masa beberapa minggu atau penggunaan berpanjangan kortikosteroid topikal. Sesetengah ubat menghalang rembesan insulin secara langsung (phenytoin, clonidine, diltiazem) atau dengan mengurangkan rizab kalium (diuretik). Hormon tiroid mempercepatkan metabolisme insulin.

Yang paling penting dan sering memberi kesan kepada tindakan beta-blocker insulin, agen hipoglikemik oral, glucocorticoids, etanol, salisilat.

Etanol menghalang glukoneogenesis di hati. Kesan ini diperhatikan dalam semua orang. Dalam hal ini, perlu diingat bahawa penyalahgunaan minuman keras di latar belakang terapi insulin boleh membawa kepada pembangunan keadaan hypoglycemic yang teruk. Jumlah alkohol yang sedikit yang diambil dengan makanan biasanya tidak menimbulkan masalah.

Penyekat beta boleh menghalang rembesan insulin, mengubah metabolisme karbohidrat dan meningkatkan ketahanan periferi pada insulin, yang membawa kepada hiperglikemia. Walau bagaimanapun, mereka juga dapat menghalang kesan catecholamine pada glukoneogenesis dan glikogenolisis, yang dikaitkan dengan risiko tindak balas hipoglikemik teruk pada pesakit diabetes. Selain itu, mana-mana penghalang beta-adrenergik boleh menutupi gejala adrenergik yang disebabkan oleh penurunan kadar glukosa darah (termasuk gegaran, penderaan), dan seterusnya mengganggu pengiktirafan hipoglisemia yang tepat pada masanya pesakit. Beta selektif1-Pengekat adrenergik (termasuk acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, metoprolol) mempamerkan kesan ini kepada tahap yang lebih rendah.

NSAID dan salicylates dos tinggi menghalang sintesis prostaglandin E (yang menghalang rembesan insulin endogen) dan dengan itu meningkatkan rembesan dasar insulin, meningkatkan sensitiviti sel-sel β dari pankreas menjadi glukosa; Kesan hipoglikemik dengan penggunaan serentak mungkin memerlukan penyesuaian dos NSAID atau salicylates dan / atau insulin, terutamanya dengan perkongsian jangka panjang.

Sebilangan besar persediaan insulin yang sedang dihasilkan, termasuk berasal dari pankreas haiwan dan disintesis oleh kejuruteraan genetik. Persiapan pilihan untuk terapi insulin adalah insinyur manusia yang sangat direka bentuk secara genetik dengan antigenicity yang minimum (aktiviti imunogenik), serta analog insulin manusia.

Persediaan insulin dihasilkan dalam botol kaca, hermetically disegel dengan stoppers getah dengan berlari aluminium, dalam apa yang dipanggil khas. jarum suntikan atau jarum picagari. Apabila menggunakan pen penunjuk syringe, persediaan berada di botol khas botol (penapis).

Asuhan insulin dan persediaan insulin untuk pentadbiran lisan sedang dibangunkan. Dengan gabungan insulin dengan detergen dan pentadbiran dalam bentuk aerosol pada mukosa hidung, tahap plasma yang berkesan dapat dicapai secepat dengan pentadbiran bolus IV. Persediaan insulin intranasal dan lisan sedang dibangunkan atau menjalani ujian klinikal.

Baca Lebih Lanjut Mengenai Diabetes

Gejala Diabetes

Indeks Glisemik