Penentuan glukosa dengan kaedah glukosa oksidase

  • Analisis

Menentukan kepekatan glukosa dalam darah adalah salah satu kajian biokimia yang paling kerap dilakukan di makmal.

Kaedah glukosa oksidase untuk menentukan glukosa dalam darah dan air kencing adalah berdasarkan tindak balas pengoksidaan glukosa di hadapan enzim glukosa oksidase dengan pembentukan hidrogen peroksida, yang seterusnya dengan kehadiran peroxidase mengoksidasi orthotolidine untuk membentuk produk berwarna; o Kepekatan glukosa dijanjikan oleh jumlah produk berwarna.

Oleh kerana kaedah glukosa oksidase bertujuan mengenal pasti glukosa, dan bukan semua jenis gula, ia digunakan dalam diagnosis pembezaan penyakit berikut:

Prinsip kaedah glukosa oksidase untuk penentuan glukosa

Glukosa di hadapan enzim glukosa oksidase dioksidakan oleh oksigen atmosfera untuk membentuk hidrogen peroksida semasa reaksi. Hidrogen peroksida di hadapan enzim peroksidase mengoksidakan orthotoluidine untuk membentuk sebatian berwarna, keamatan warna yang berkadar dengan kandungan glukosa. Kaedah ini membolehkan anda menentukan tahap glukosa dalam plasma darah, cecair serum dan cerebrospinal.

Glukosa darah biasa, mmol / l

- dalam plasma, dalam natsheartse

  • bayi baru lahir - 1.7 - 4.2
  • kanak-kanak dari 6 minggu hingga 15 tahun - 3.3 - 5.4
  • dewasa (lelaki, wanita) - 3.9 - 5.6

- dalam serum, dalam natsheartse

  • bayi baru lahir - 2.6 - 4.2
  • kanak-kanak dari 6 minggu hingga 2 tahun - 3.3 - 5.4
  • dewasa (lelaki, wanita) - 3.9 - 5.6

Reagen diperlukan untuk penentuan glukosa dengan kaedah glukosa oksidase

1. Natrium klorida 9 gram / liter (larutan isotonik): disiapkan dengan melarutkan 0.9 g NaCl dalam 100 ml air.

2. Zink sulfat, 50 g / l: 5 g zink sulfat (ZnSO4) dibubarkan dalam air, jumlahnya dibawa kepada 100 ml.

3. Natrium hidroksida, 0.3 mol / l: disediakan dengan melarutkan 1.2 g NaOH dalam 100 ml air, kepekatan diperiksa oleh titrasi (ia mestilah 0.3 n).

4. Orthotoluidine, penyelesaian 1%: 1 g ubat dibubarkan dalam 100 ml alkohol mutlak. Penyelesaiannya boleh disimpan di dalam peti sejuk di dalam kuah dengan penyumbat kaca selama beberapa bulan. Produk yang boleh dijual secara komersil boleh disucikan dengan penghabluran semula, yang mana ia dibubarkan dalam alkohol mutlak, air ditambah dan kristal yang dihidupkan disedut pada penuras, kemudian dikeringkan di atas kalsium klorida.

5. Larutan pengacuan asetat pH 4.8: campurkan 4 bahagian 0.25 n asid asetik (cek oleh titrasi) dan 6 bahagian 0.25 n natrium asetat (mengandungi 34 g CH3COONa X ZN2O dalam 1 liter).

6. Glukosa oksidase adalah penyediaan kering dengan aktiviti 3000 unit / mg atau lebih.

7. Peroksidase teruk. 1 mg dibubarkan dalam 5 ml buffer acetate, ia boleh disimpan di dalam peti sejuk selama beberapa hari.

8. Reagen kerja: larutkan 2 mg glukosa oksidase dan 1 mg peroksidase dalam 80 ml penahan asetik, tambah 1 ml 1% larutan orthotoluidine, campuran dan masukkan isipadu kepada 100 ml dengan larutan penampan. Reagen kerja mestilah telus, tidak berwarna atau mempunyai kelabu hijau yang lemah, yang mana ia stabil apabila disimpan dalam keadaan sejuk. Sekiranya warna itu sengit atau selepas beberapa jam selepas penyediaan, satu precipitate mula jatuh, ini bermakna orthotoluidine tidak cukup murni dan perlu direkristalisasi.

9. Penyelesaian glukosa penentukuran. Glukosa pra-kering pada suhu 37 ° C dan disimpan dalam desiccator. Pertama, sediakan penyelesaian asas dengan kepekatan 50 mmol / l, yang 180 mg bahan dibubarkan dalam 20 ml larutan tepu (kira-kira 0.3%) asid benzoik. Dari penyelesaian ini, sediakan penyelesaian penentukuran kerja yang mengandungi 3; 6; 9; 12; 15; 18 dan 21 mmol / l, yang mana mereka mengambil 0.6; 1.2; 1.8; 2.4; 3; 3.6 dan 4.2 ml penyelesaian asas dan membawa larutan asid benzoik tepu kepada jisim 10 ml. Penyelesaian ini mengandungi glukosa dalam kepekatan yang sama kerana ia berlaku dalam darah, yang memudahkan pengiraan semasa penentukuran.

Kemajuan penentuan glukosa dengan kaedah glukosa oksidase

Di dalam tiub sentrifug menambah 1.1 ml larutan natrium klorida, 0.4 ml larutan zink sulfat dan 0,4 ml larutan 0.3 n NaOH, campuran; pada masa yang sama, gel zink hidroksida yang sangat tipis terbentuk, 0.1 ml penyelesaian darah atau penentukuran dilepaskan ke dalamnya, dicampur semula dan disentri selepas 10 minit pada kelajuan 3000 rpm selama 10 minit.

Untuk 1 ml supernatan menambah 3 ml reagen bekerja dan campuran dengan perlahan.

Warna secara beransur-ansur mula berkembang, yang pada suhu bilik normal mencapai maksimum dalam 13-15 minit, dan kemudian secara beransur-ansur berkurang. Secara fotometrik selalu selepas tempoh masa yang sama selepas menambahkan reagen kerja dalam cuvettes dengan panjang jalur optik 1 sentimeter dengan penapis cahaya merah (panjang gelombang 625 nm) berbanding pengalaman terbiar, yang disusun serentak dengan sampel kerja, tetapi bukan darah, mengambil larutan natrium klorida fisiologi.

Apabila menyediakan graf penentukuran, 0.1 ml penyelesaian penentukuran yang sesuai diambil daripada sampel darah.

Pengiraan glukosa boleh dijalankan mengikut peraturan perkadaran atau jadual penentukuran, untuk membina kepekatan glukosa (mmol / l) diletakkan pada satu paksi, dan nilai kepupusan adalah pada yang lain.

Nota tentang kaedah penentuan glukosa dengan kaedah glukosa oksidase

1. Anda boleh melepaskan darah dari pipet ke dalam larutan isotonik natrium klorida, kemudian menambah larutan zink sulfat dan NaOH.

2. Dengan kerja sistematik, tidak perlu sentiasa membuat jadual penentukuran untuk semua mata, mencukupi untuk memproses sampel kosong dan 2-3 mata dalam julat 3-9 mmol / l setiap hari, dan membina jadual penentukuran penuh hanya apabila menukar reagen atau menyesuaikan prosedur.

Kaedah glukosa oksidase untuk menentukan glukosa

Kaedah glukosa oksidase digunakan untuk menentukan kepekatan glukosa secara eksklusif dalam pelbagai cecair badan. Kelebihan ujian ini adalah ketepatannya. Diagnostik, berbeza dengan kaedah cepat, membolehkan untuk mendedahkan jumlah glukosa tulen, tanpa sebarang fruktosa dan gula lain. Prinsip tindak balas ini adalah untuk mewarnai penyelesaian, yang berlaku akibat interaksi agen pengoksidaan dengan pewarna khusus. Penilaian hasil penyelidikan dijalankan dengan menggunakan kaedah colorimetry dan perbandingan dengan penyelesaian standard.

Bilakah kaedah glukosa oksidase ditetapkan?

Ujian ini digunakan untuk mengesan toleransi gula terjejas dan perkembangan pra-diabetes, serta pada ketinggian penyakit ini. Tetapi analisis jarang digunakan untuk tujuan tersebut, ini disebabkan oleh kos yang tinggi dan lama menunggu hasilnya. Selalunya, penentuan glukosa dalam darah dan air kencing menggunakan kaedah ini digunakan dalam diagnosis pembezaan penyakit seperti:

  • sindrom intoleransi laktosa;
  • intoleransi fruktosa;
  • pembebasan fruktosa dengan cecair badan;
  • Peningkatan kepekatan pentosis dalam air kencing.

Kelebihan ujian glukosa oksidase yang tidak diragukan adalah ketepatannya.

Apakah asas kaedah ini?

Terdapat pelbagai cara untuk menentukan kepekatan glukosa dalam darah, tetapi glukosa oksidase adalah yang paling tepat. Intinya adalah bahawa interaksi gula dengan oksigen di udara mengoksidasi reagen. Hidrogen peroksida dilepaskan ke dalam larutan. Bahan ini berinteraksi dengan orthotoluidine, membentuk sebatian berwarna. Untuk tindak balas tindak balas ini memerlukan kehadiran enzim khas. Glukosa oksidase mesti hadir dalam tindak balas pengoksidaan, dan peroksidase dalam pewarnaan cecair. Keamatan warna penyelesaian bergantung pada kandungan glukosa dan paling sengit dengan kandungannya yang tinggi.

Intipati kaedah glukosa oksidase untuk menentukan glukosa

Penilaian keputusan berlaku menggunakan kaedah kuantitatif fotometri pada selang masa yang sama. Pastikan anda menggunakan penyelesaian penentukuran yang mengandungi kadar gula tertentu dan, bermula dari itu, anda boleh menilai kepekatan glukosa dalam cecair badan, selalunya dalam darah.

Bagaimanakah analisis dilakukan?

Bahan diambil dari pesakit pada perut kosong. Untuk ujian menggunakan darah vena dalam jumlah 5 ml. Pada malam sebelum diagnosis, pesakit menunjukkan diet yang ketat. Ini akan membolehkan untuk menghakimi kebolehpercayaan keputusan dan mengecualikan kemungkinan kesalahan analisis. 2 hari sebelum penarikan darah, pesakit mesti melepaskan tabiat buruk minum dan merokok. Ia juga perlu untuk mengehadkan pengambilan hidangan terlalu manis dan, jika boleh, elakkan situasi yang tertekan.

Selalunya, kaedah penentuan kepekatan glukosa ini dilakukan dengan kaedah sentrifugasi, yang digunakan untuk memisahkan elemen berbentuk. Jumlah gula ditentukan dalam plasma. Apabila semua reagen yang diperlukan ditambah, warna itu diperhatikan selepas 20 minit jika ujian dijalankan pada suhu bilik. Pengiraan tahap glukosa dijalankan mengikut jadual penentukuran atau menggunakan peraturan bahagian.

Reagen untuk penyelidikan

Untuk menentukan gula adalah paling mudah untuk menggunakan kaedah pesat untuk penentuan glukosa dalam darah. Ini adalah kerana kemudahan penggunaan dan hasil yang cepat. Di samping itu, pesakit tidak perlu pergi ke makmal atau hospital. Tetapi tidak seperti ujian oksidase glukosa, diagnosis seperti ini tidak boleh dipercayai. Oleh kerana ia tidak membezakan glukosa daripada gula lain dan menentukan kepekatan mereka bersama-sama.

Asas tindak balas oksidase glukosa ialah penyelesaian 9% natrium klorida dan zink sulfat 50%. Mereka ditambah pada peringkat sentrifugasi darah. Di samping itu, gunakan larutan penampan dengan asid asetik dan natrium asetat. Kaedah titrasi menentukan pHnya pada 4.8. Selepas itu, oksidase glukosa ditambah, yang menyebabkan hidrogen peroksida dan peroksidase, yang terlibat dalam pewarnaan penyelesaian kepada kepekatan yang dikehendaki untuk mendapatkan hasil yang tepat.

Standard semasa analisis

Jumlah gula diukur dalam unit khas - milimol per liter larutan.

Ujian darah glukosa oksidase mesti dilakukan pada perut kosong dan plasma atau serum digunakan untuk ini. Kadar bilangan orang dewasa untuk wanita dan lelaki adalah 3.3-5.5. Bagi kanak-kanak di bawah umur 15 tahun, angka ini sedikit lebih rendah dan berbeza antara 3.2 dan 5.3. Dalam bayi baru lahir, glukosa darah adalah 1.7-4.2. Peningkatan prestasi diperhatikan dengan perkembangan pesakit diabetes mellitus atau melanggar toleransi glukosa. Keadaan ini adalah prediabetes, dan jika ia tidak dirawat tepat pada waktunya, maka tidak lama lagi ia akan membawa kepada perkembangan patologi yang teruk ini.

Nombor KERJA 1. PENGENALAN KUANTITATIF GLUCOSE DALAM DARAH. METODE ENZYMATIC (GLUCOSOOXIDAL)

RASIONAL UNTUK PRESTASI KERJA. Penentuan glukosa dalam seluruh darah atau plasma dilakukan pada setiap pesakit untuk menilai keadaan metabolisme karbohidrat dan mendiagnosis patologi (hyperglycemia, hipoglikemia). Kaedah enzimatik berdasarkan pengoksidaan glukosa oleh glukosa oksidase kepada asid gluconic di hadapan oksigen digunakan untuk menentukan kandungan glukosa darah. Kaedah ini sangat spesifik untuk penentuan D-glukosa dalam kehadiran bahan pengurangan lain yang terkandung dalam ekstrak tisu dan cecair biologi.

PRINSIP KAEDAH. Glukosa oksidase adalah enzim kompleks yang mengandungi FAD sebagai kumpulan prostetik. Apabila glukosa dioksidakan oleh oksidase glukosa, dua atom hidrogen dipisahkan dari atom karbon pertama dalam molekul glukosa. Selanjutnya, kedua-dua atom hidrogen ini dipindahkan ke FAD, FADH terbentuk2. Yang terakhir memindahkan atom hidrogen ke oksigen molekul untuk membentuk H2Oh2. Kemudian H2Oh2 ia dipotong oleh enzim peroksidase ke dalam air dan oksigen atom, yang mengoksidakan kromogen (pewarna), yang menjadi berwarna semasa pengoksidaan.

Kaedah glukosa oksidase

Hari ini, kaedah berdasarkan penggunaan enzim glukosa oksidase digunakan secara meluas. Kaedah ini berdasarkan tindak balas berikut:

Glukosa oksidase mematalikan pemindahan dua atom hidrogen dari atom karbon pertama glukosa ke oksigen yang larut dalam reagen cecair. Semasa tindak balas, hidrogen peroksida terbentuk dalam jumlah equimolar. Ya kepekatan hidrogen peroksida yang terbentuk adalah sama dengan kepekatan glukosa yang ditentukan. Oleh itu, penggunaan reaksi oxidase glukosa, tugas berubah menentukan kepekatan glukosa dalam tugas menentukan kepekatan hidrogen peroksida, yang, seperti yang akan ditunjukkan di bawah, adalah lebih mudah pertama. Dan di sini terdapat beberapa kaedah yang banyak digunakan hari ini dalam amalan makmal (lihat rajah).

Antara kaedah yang dinyatakan di atas rakaman paling banyak kaedah biokimia fotometri di mana molekul hidrogen peroksida dengan peroxidase enzim melekang untuk membentuk bentuk yang aktif oksigen - anion superoxide radikal - O2 -, yang seterusnya mengoksidakan kromogen, yang membawa kepada perubahan ketara dalam spektrum penyerapan kromogen.

Populariti tinggi kaedah ini untuk menentukan glukosa adalah disebabkan oleh kekhususan yang tinggi dan kemudahan pelaksanaannya. Kaedah ini boleh dilaksanakan dengan menggunakan fotometer konvensional, serta menggunakan autoanalyzers biokimia automatik.

Kaedah glukosa oksidase diiktiraf hari ini sebagai salah satu kaedah kuantitatif yang paling tepat untuk penentuan glukosa. Sebagai bahan biologi digunakan sebagai serum, dan seluruh darah. Apabila bekerja dengan kedua perlu mengambil kira fakta bahawa penangkapan bahagian serum darah kapilari (plasma) bergantung kepada hematokrit, yang boleh menjejaskan ketepatan keputusan. Oleh itu, apabila menentukan glukosa dengan kaedah yang dinyatakan di atas, lebih baik menggunakan serum pesakit.

Bersama dengan kaedah fotometrik titik akhir, beberapa tahun yang lalu, kit muncul di mana kaedah fotometrik kinetik dilaksanakan. Kaedah ini terdiri dalam fakta bahawa pada nisbah tertentu oxidase glukosa dan aktiviti peroxidase, kadar pembentukan sebatian berwarna untuk beberapa masa selepas penambahan sampel untuk penyelesaian kerja akan berkadar dengan kepekatan glukosa dalam sampel. Kelebihan kaedah ini adalah bahawa hasilnya tidak bergantung kepada kehadiran sebatian lain dalam sampel, kerana penyerapan kedua adalah stabil dari masa ke masa. Kaedah ini memerlukan penggunaan fotometer kinetik, penganalisis separa automatik atau penganalisis biokimia automatik. Pengukuran kepekatan glukosa dari seluruh darah mudah dilakukan dengan menggunakan instrumen yang operasinya berdasarkan prinsip pengukuran amperometri, menggunakan sensor enzim khas. Hidrogen peroksida adalah sebatian kimia yang sangat tidak stabil, dan ia boleh berfungsi sebagai sumber zarah yang dikenakan. Inilah yang digunakan dalam sensor enzim jenis membran atau dalam unsur-unsur elektrokimia glucometers mudah alih.

Sebagai kesimpulan, kita harus menyebutkan kelemahan kaedah glukosa oksidase. Yang terhasil hidrogen peroksida dan anion radikal superoksida bukan sahaja boleh mengoksidakan chromogen, tetapi bahan-bahan lain di dalam cecair biologi: asid askorbik, asid urik, bilirubin. Dalam kes ini, dengan itu, bahagian peroksida, mengambil bahagian dalam pengoksidaan chromogen yang dikurangkan, yang membawa kepada memandang rendah keputusan glukosa. Kaedah ini linear, sebagai peraturan, sehingga 20-30 mmol / l glukosa.

Penentuan kuantitatif glukosa darah dengan kaedah glukosa oksidase

Prinsip kaedah ini. Kaedah ini didasarkan pada kekhususan tindakan enzim glukosa oksidase. Enzim ini mengoksidasi glukosa di hadapan oksigen molekul untuk membentuk gluconolactone, yang secara spontan menghidrolisis asid glukonik. Glukosa oksidase mengoksidakan glukosa untuk membentuk hidrogen peroksida (H2Oh2), yang di bawah tindakan peroksidase bertindak balas dengan 4-aminoantipirin dan fenol. Hasilnya adalah sebatian merah jambu, ketumpatan optik yang pada 510 nm adalah berkadar dengan kepekatan glukosa dalam sampel.

2 N2Oh2 + 4-aminoantipyrin + phenol → quinone imine + 4H2Oh

Peralatan: KFK, emparan, termostat, tripod, tiub ujian, pipet, bahan biologi, reagen yang terkandung dalam penyelesaian kerja.

sampel ujian, ml

sampel piawai, ml

ujian tunggal (N2O), ml

Penyelesaian glukosa penentukuran (piawai)

Tiub dieram dalam termostat pada 37 ° C selama 15 minit, kemudian UFC kolorimetriruyut pada sekurang-penapis cahaya hijau dalam sel-sel dengan ketebalan lapisan 5 mm terhadap kosong (H2O). Warna merah jambu stabil selama 1 jam selepas pengeraman.

Pengiraan kandungan glukosa yang dihasilkan oleh formula:

C = x C standard, di mana

C ialah kandungan glukosa dalam sampel eksperimen, mol / l;

Eop adalah kepadatan optik sampel;

Est ialah ketumpatan optik bagi sampel penentukuran;

Standard - kandungan dalam penyelesaian penentukuran, mol / l.

Nilai normal:  bayi baru lahir - 2.8-4.4 mmol / l

 kanak-kanak - 3.9 -5.8 mmol / l

 orang dewasa - 3.9 - 6.2 mmol / l

Hipoglikemia (HGH). Peningkatan glukosa darah adalah disebabkan oleh banyak sebab, yang mana terdapat dua kumpulan hiperglikemia.

1. Insular - yang berkaitan dengan kandungan yang tidak mencukupi dalam badan insulin atau disebabkan oleh tindakan yang tidak berkesan.

2. Extreseular (extraterular) - tidak bergantung kepada kesan insulin.

Proses berikut adalah paling penting dalam pembentukan HGH: kerosakan glikogen yang dipertingkatkan; peningkatan neoglucogenesis; perencatan sintesis glikogen; pengurangan dalam penggunaan glukosa oleh tisu-tisu di bawah pengaruh golongan mukmin hormon insulin: hormon pertumbuhan, glucocorticoids, tiroksin, thyrotropin.

Hiperglikemia alergi dicatat dengan bekalan glukosa yang berlebihan dalam darah (contohnya, hiperglikemia di bawah beban gula). Hiperkolemia "hepatik" berlaku dalam luka diffuse hati.

Hiperglikemia yang berterusan dan teruk selalunya mengiringi diabetes mellitus. Diterima menyediakan insulin kencing bergantung kencing manis dan insulin kencing manis bergantung kepada, atau, masing-masing, diabetes jenis I dan diabetes jenis II. Pembentukan diabetes mellitus jenis I dikaitkan terutamanya dengan sintesis terjejas dan pertukaran insulin.

Kumpulan kedua hiperglikemia dikaitkan terutamanya dengan hiperfungsi kelenjar endokrin yang menghasilkan hormon - antagonis insulin. Ia diperhatikan dalam penyakit seperti sindrom dan penyakit Cushing, acromegaly, hipertiroidisme, pheochromocytoma, glyukoganoma. Tahap gula darah meningkat dan penyakit hati tertentu (khususnya, 10-30% daripada pesakit dengan sirosis hati), hemochromatosis (pigmen sirosis, diabetes gangsa).

Hipoglisemia (HGP) - Pengurangan dalam glukosa darah - yang paling sering dikaitkan dengan peningkatan mutlak atau kadar insulin dalam darah. Vnepankreaticheskim hipoglisemia diperhatikan akibat daripada ketidakseimbangan antara setakat proses glycogenolysis dan gluconeogenesis di dalam hati semasa penyakit hati hepatitis akut dan kronik, sirosis, akut dan subakut, mabuk alkohol, keracunan oleh arsenik, fosforus, semasa jaundis berpanjangan mekanikal, hati kongestif, utama atau kanser hati metastatik. kepekatan glukosa darah mengurangkan sering diperhatikan pada pesakit dengan kanser esophageal dan tumor malignan lain penyetempatan vnepankreaticheskim (fibroma, fibrosarcoma, neuroma), serta muntah tidak terkawal, tiada selera makan, kencing manis hepatik, uremia, penyusuan yang banyak dan glycosuria di kalangan wanita hamil.

Hipoglikemia boleh menjadi punca utama akibat trauma mental, ensefalitis, pendarahan subarachnoid, tumor otak.

1. Gangguan keturunan penghadaman karbohidrat.

2. Apakah jenis hyperglucose yang diketahui oleh anda?

3. Apakah punca hiperkglosemia patologi?

4. Apakah sebabnya diabetes mellitus yang bergantung kepada insulin?

5. Apakah punca-punca biokimia penyakit keturunan: a) glikogenosis? b) agilagogenosis? c) fructosemia? d) galactosemia?

6. Apakah perubahan biokimia dalam metabolisme karbohidrat semasa berpuasa?

7. Prinsip kaedah menentukan toleransi glukosa.

Kaedah oksidase glukosa dan hexokinase untuk menentukan glukosa serum dalam darah

Diagnosis tepat, rawatan preskripsi memerlukan satu siri ujian makmal.

Kaedah menentukan glukosa serum adalah alat yang paling penting untuk mengesan hyper- dan hypoglycemia pada pesakit diabetes mellitus.

Kaedah ini membolehkan penyesuaian gangguan metabolik data terapi perubatan. Tahap glukosa diagnostik juga boleh ditentukan di seluruh darah dan plasmanya.

Kaedah untuk penentuan glukosa darah

Kaedah untuk menentukan jumlah glukosa dalam darah berkembang banyak.

Sebahagian daripada mereka (penguranganometrik, kolorimetri) tidak dapat digunakan kerana ketoksikan yang tinggi dan ketepatan yang rendah hasilnya.

Kajian enzim yang paling biasa digunakan. Kaedah glukosa oksidase adalah kaedah tindak balas warna yang berlaku apabila karbohidrat dipanaskan. Hexokinase menentukan aktiviti darah pada hexokinase.

Kaedah glukosa oksidase

Kaedah glukosa oksidase untuk menentukan glukosa darah adalah berdasarkan tindak balas pengoksidaan di bawah pengaruh enzim. Ini membentuk hidrogen peroksida, ia menyerap bahan Chromogen, kepekatan yang menentukan jumlah glukosa.

Kaedah glukosa oksidase digunakan untuk:

  • intoleransi fruktosa keturunan;
  • pentozurii;
  • intoleransi laktulosa.

Kelemahan kajian ini ialah hidrogen peroksida mampu mengoksida kromogen dan askorbat, asid urik dan bilirubin yang ada dalam darah. Kirakan jumlah kaedah fotometrik glukosa, intensiti pewarnaan dibandingkan dengan graf penentukuran.

Di bawah keadaan makmal, tahap bahan boleh ditentukan:

  1. dalam darah vena. Penganalisis automatik digunakan;
  2. dalam darah kapilari. Pagar dijalankan dari jari.

Kaedah elektrokimia terdiri daripada menggunakan elektrod yang mengandungi oksidase glukosa. Jumlah hidrogen peroksida yang dihasilkan, atau tahap oksigen yang masih digunakan semasa proses pengoksidaan, ditentukan.

Kaedah Hexokinase

Bahan ini adalah enzim yang paling penting dalam metabolisme glukosa, yang menghadkan kelajuan proses dalam sel.

Di bawah keadaan makmal, di bawah tindakan hexokinase, glukosa di fosforilasi oleh adenosine trifosfat.

Hasil daripada tindak balas, molekul organik terbentuk, jumlahnya ditentukan oleh tahap penyerapan cahaya dalam zon ultraviolet. Reaksi heksokinase positif yang cepat juga boleh menjadi tanda berlakunya tumor malignan.

Penyediaan untuk analisis

Ujian glukosa serum darah ditetapkan untuk:

Sebelum analisis, anda perlu mengikuti beberapa syarat supaya keputusannya dapat dipercayai seperti yang mungkin:

  1. penyelidikan dijalankan pada perut kosong. Bahan yang diambil pada waktu pagi;
  2. beberapa hari sebelum diagnosis, adalah perlu untuk mengelakkan penuaan fizikal berat, tekanan;
  3. Dalam diet harian pesakit mesti sekurang-kurangnya 150 gram karbohidrat. Dengan kekurangan, tahap glukosa akan bertambah, dan ia jatuh perlahan, yang mengganggu analisis data;
  4. hari sebelum diagnosis tidak boleh merokok dan minum minuman beralkohol;
  5. adalah mustahil untuk menjalankan penyelidikan selepas operasi berat, melahirkan anak, di hadapan keradangan. Kontraindikasi dalam analisis sirosis hati, pembesaran penyakit perut, proses tumor;
  6. beberapa hari sebelum kajian itu, seseorang tidak boleh menjalani prosedur fisioterapeutik, mengambil pil kontraseptif, ubat diuretik, ubat psikotropik, kafein.

Analisis ini dapat memberi kesan positif palsu pada hipokalemia dan penyakit endokrin (Cushing syndrome, thyrotoxicosis).

Norma glukosa dalam serum darah mengikut umur

Penunjuk biasa bergantung kepada umur:

  • darah kord mungkin mengandungi 2.5 hingga 5.3 mmol / l;
  • pada bayi pramatang - dari 1.1 hingga 3 mmol / l;
  • kanak-kanak hari pertama kehidupan - dari 2.22 hingga 3.33;
  • pada umur 2.7 hingga 4.4;
  • pada kanak-kanak berumur 6 tahun ke atas - dari 3.3 hingga 5.5 mmol / l;
  • pada orang dewasa sehingga 60 tahun - dari 4.4 hingga 6.3;
  • pada orang tua - dari 4.6 hingga 6.1 mmol / l.

Hipoglisemia pada orang dewasa didiagnosis dengan nilai glukosa kurang daripada 3.3 mmol / l, dan hiperglikemia - lebih daripada 6.1 mmol / l.

Kaedah glukosa oksidase untuk penentuan glukosa dalam plasma

Kami gembira untuk mengalu-alukan anda di laman web ini www.unimedao.ru!

Terima kasih kerana menjawab soalan kami.

11/19/2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.


Dari arkib akhbar "News A / O Unimed"

Penentuan kepekatan glukosa dalam darah adalah salah satu kajian biokimia yang paling kerap dilakukan di QDL. Alasan populariti yang luar biasa ujian itu dikaitkan dengan insiden kencing manis yang tinggi. Ujian ini dilakukan dalam klinik pesakit dalam dan pesakit luar. Pesakit yang menghidap diabetes terpaksa memeriksa tahap glukosa dalam darah di rumah, kerana tanpa maklumat ini, sukar untuk mereka menyesuaikan diet, senaman, penggunaan insulin dan ubat antidiabetik lain. Kepentingan luar biasa ujian dan jumlah besar penyelidikan yang dilakukan telah mendorong para pemaju untuk membuat pelbagai jenis peranti dan kaedah untuk menentukan kepekatan glukosa dalam darah.

Pada masa ini, terdapat banyak kaedah untuk menentukan glukosa. Mereka boleh diklasifikasikan sebagai berikut.

Kaedah untuk penentuan glukosa dalam serum

- fotometrik titik akhir

- fotometri reflektif - kimia kering

Dua kaedah pertama adalah sangat tidak selesa, beracun dan mempunyai ketepatan yang rendah, jadi kami tidak akan memikirkannya.

Kaedah glukosa oksidase

Hari ini, kaedah berdasarkan penggunaan enzim glukosa oksidase digunakan secara meluas. Kaedah ini berdasarkan tindak balas berikut:

Glukosa oksidase mematalikan pemindahan dua atom hidrogen dari atom karbon pertama glukosa ke oksigen yang larut dalam reagen cecair. Semasa tindak balas, hidrogen peroksida terbentuk dalam jumlah equimolar. Ya kepekatan hidrogen peroksida yang terbentuk adalah sama dengan kepekatan glukosa yang ditentukan. Oleh itu, penggunaan reaksi oxidase glukosa, tugas berubah menentukan kepekatan glukosa dalam tugas menentukan kepekatan hidrogen peroksida, yang, seperti yang akan ditunjukkan di bawah, adalah lebih mudah pertama. Dan di sini terdapat beberapa kaedah yang banyak digunakan hari ini dalam amalan makmal (lihat rajah).

Antara kaedah yang dinyatakan di atas rakaman paling banyak kaedah biokimia fotometri di mana molekul hidrogen peroksida dengan peroxidase enzim melekang untuk membentuk bentuk yang aktif oksigen - anion superoxide radikal - O2 -, yang seterusnya mengoksidakan kromogen, yang membawa kepada perubahan ketara dalam spektrum penyerapan kromogen.

Dalam rajah. Angka 1 dan 2 menunjukkan spektrum penyelesaian kerja sebelum dan selepas menambah larutan glukosa piawai. Penyerapan maksimum campuran reaksi - (reagen + glukosa) berada di rantau 500 nm. Oleh itu, perubahan ketumpatan optik bagi tindak balas akhir pada panjang gelombang 480-520 nm adalah berkadar dengan kepekatan glukosa yang terkandung di dalam sampel.

Populariti tinggi kaedah ini untuk menentukan glukosa adalah disebabkan oleh kekhususan yang tinggi dan kemudahan pelaksanaannya. Kaedah ini boleh dilaksanakan menggunakan fotometer konvensional (lebih baik daripada fotometer biokimia khusus seperti Mikrolab 540), atau dengan bantuan autoanalyzer biokimia automatik.

Bersama dengan kaedah fotometrik titik akhir, beberapa tahun yang lalu, kit muncul di mana kaedah fotometrik kinetik dilaksanakan. Kaedah ini terdiri dalam fakta bahawa pada nisbah tertentu oxidase glukosa dan aktiviti peroxidase, kadar pembentukan sebatian berwarna untuk beberapa masa selepas penambahan sampel untuk penyelesaian kerja akan berkadar dengan kepekatan glukosa dalam sampel. Kelebihan kaedah ini adalah bahawa hasilnya tidak bergantung kepada kehadiran sebatian lain dalam sampel, kerana penyerapan kedua adalah stabil dari masa ke masa. Kaedah ini memerlukan penggunaan fotometer kinetik, contohnya Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, penganalisis separuh automatik, seperti Clima 15, atau penganalisis biokimia automatik. Pengukuran kepekatan glukosa dari seluruh darah mudah dilakukan dengan menggunakan instrumen yang operasinya berdasarkan prinsip pengukuran amperometri, menggunakan sensor enzim khas. Hidrogen peroksida adalah sebatian kimia yang sangat tidak stabil dan boleh berfungsi sebagai sumber zarah yang dikenakan. Inilah yang digunakan dalam sensor enzim jenis membran atau dalam unsur-unsur elektrokimia glucometers mudah alih.

Sampel keseluruhan darah (biasanya 20 μl) dicairkan dalam larutan penyangga sistem (sel darah merah dimusnahkan), dan kemudian diberi makan melalui sel ke dalam sel aliran. Glukosa, menjalani pengoksidaan di bawah pengaruh enzim glukosa oksidase, terletak pada membran. Hidrogen peroksida yang terhasil meresap melalui membran dan dioksidakan lagi dalam tindak balas pemangkin di bawah tindakan platinum. Penyebaran hidrogen peroksida pada permukaan platinum membentuk sebanding semasa dengan bilangan molekul H2Oh2. Isyarat yang diperolehi itu diproses oleh peranti pada nilai voltan yang sepadan. Nilai yang diukur adalah berkadar dengan kepekatan glukosa dalam sampel.

Sebagai contoh instrumen yang menggunakan kaedah yang diterangkan di atas, kita boleh menyebut Biosen glukosa penganalisis (Jerman). Peranti ini mudah digunakan bukan sahaja di hospital, tetapi juga di poliklinik, di mana ujian glukosa dilakukan terutamanya daripada darah kapilari.

Langkah penting dalam pembangunan kaedah diagnostik makmal klinikal adalah kemunculan "kimia kering". Sememangnya, salah satu aplikasi pertama teknologi ini adalah tugas menentukan glukosa dalam darah pesakit. Peranti pertama adalah ketara dalam ketepatan kepada kaedah penyelidikan makmal tradisional. Bagaimanapun, dari masa ke masa, beberapa firma berjaya mengembangkan jalur diagnostik dan fotometer reflektif yang memberikan ketepatan analisis yang sangat tinggi. Ia adalah amat popular di seluruh dunia pada masa ini adalah One Touch meter glukosa darah dan ujian jalur mereka dibuat oleh Life Scan (Amerika Syarikat), yang berjaya menggabungkan ketepatan analisis kaedah enzim kuantitatif, dengan kelajuan dan kesederhanaan "kimia kering".

Satu Sentuhan glukosa darah direka untuk mengukur tahap glukosa dengan cepat dan tepat dalam darah keseluruhan. Strip Ujian One Touch mengandungi semua komponen kimia yang diperlukan untuk kaedah glukosa oksidase dua langkah, termasuk enzim glukosa oksidase dan peroksidase, yang terserap ke membran hidrofilik berliang yang unik. Hasil tindak balas adalah pembentukan kompleks berwarna. Keamatan warna maju dicatatkan dengan miniphotometer reflektif.

Jalur ujian membran One Touch menyerupai span dengan liang mikroskopik dan melakukan fungsi triple. Ia bertindak: 1) sebagai takungan, mengumpul jumlah darah yang diperlukan, 2) sebagai penapis, menghalang bahan selular padat (erythrocytes, leukosit, dan sebagainya), 3) sebagai permukaan optik yang lancar di mana cahaya yang dipantulkan diukur. Fungsi yang terakhir, khususnya, adalah sangat penting untuk pengendalian peranti. Ia membolehkan membaca bahagian bawah jalur, sementara darah kekal pada bahagian atas jalur ujian. Oleh itu, tidak perlu membasuh (membuang) darah dari permukaan jalur ujian.

Di samping itu, membran mempunyai sifat-sifat hidrofilik, oleh sebab itu setetes darah "menarik" ke permukaan jalur ujian apabila ia menyentuh.

Peranti One Touch termasuk dua LED khas. Memproses warna yang dibangunkan pada jalur ujian adalah seperti berikut. Sebaik sahaja jalur ujian dimasukkan ke dalam peranti, pembacaan sifar berlaku. Pada masa ini pada paparan yang kita lihat: "WAIT". Apabila setetes darah digunakan pada jalur ujian, plasma darah disedut oleh membran, dan sementara eritrosit dan plasma berlebihan kekal di permukaan membran. Setelah menyerap setetes darah, pewarnaan segera berlaku. Peranti merekodkan perubahan dalam magnitud pantulan dan secara automatik memulakan pemasa. Selepas 45 saat, tindak balas kimia berakhir, hasil refleksi cahaya diproses. Produk tindak balas berwarna menyerap cahaya yang dipancarkan oleh LED pertama. Sel darah dan plasma berlebihan juga menyerap cahaya yang dipancarkan oleh diod. Untuk membetulkan refleksi latar belakang, bacaan kedua dilakukan oleh LED kedua pada jarak gelombang yang berbeza. Perbezaan antara isyarat dari LED pertama dan kedua membawa maklumat tentang penyerapan cahaya oleh kromogen. Isyarat yang diterima daripada kromogen untuk menganggarkan kepekatan glukosa dikaitkan dengan penentukuran khas. Semua peranti One Touch ditentukur menggunakan kaedah rujukan pada penganalisis glukosa makmal. Dengan prosedur ini, lengkung penentukuran standard diperolehi. Perlu diingatkan bahawa agak sukar untuk menubuhkan pengeluaran jalur ujian, yang akan sama sekali sama dengan kimia, disebabkan oleh kepekatan reagen yang sangat rendah. Untuk menyelesaikan masalah ini, lengkung penentukuran standard digunakan, terdiri daripada 16 garis penentukuran. Kawalan kualiti dilakukan sejurus selepas pengeluaran jalur ujian, yang membolehkan untuk menentukan mana-mana garisan penentukuran (dari 1 hingga 16) boleh digunakan pada jalur ujian ini. Ini adalah nombor kod yang dipanggil, yang dilekatkan pada pembungkusan jalur ujian. Ini 16 garisan penentukuran juga diprogramkan dalam mikropemproses instrumen. Untuk memperoleh hasil yang tepat, nombor kod yang ditunjukkan pada pembungkusan jalur ujian ditetapkan dalam peranti menggunakan butang kod. Jadi, kod yang dipasang dengan betul pada instrumen boleh menyebabkan ralat pengukuran.

Sejak kedatangan peranti One Touch di pasaran, sejumlah besar kajian klinikal telah diluluskan di makmal Rusia, Amerika dan Eropah. Salah satu kajian tersebut telah dijalankan oleh Pusat Ilmiah Endokrinologi Akademi Sains Perubatan Rusia atas permintaan Persatuan Diagnostik Makmal Perubatan Rusia. Pakar pusat menjalankan analisis perbandingan dua kaedah untuk mengukur tahap glukosa darah. Hasil yang diperoleh pada One Touch dibandingkan dengan data yang diperoleh pada penganalisis biokimia Spectrum II (Abbott Laboratories, USA), yang menerapkan kaedah hexokinase untuk penentuan glukosa. 190 sampel darah daripada 95 pesakit diperiksa. Koefisien korelasi keputusan adalah 0.98641. Koefisien variasi dalam julat normal dan patologi pada meter One Touch tidak melebihi 2.5%.

Laporan rasmi Pusat Penyelidikan Endokrinologi Akademi Sains Perubatan Rusia berkata: "Satu peranti Touch mempunyai ketepatan dan ketepatan yang tinggi, serta pelbagai pengukuran. Mereka boleh digunakan untuk mendiagnosis keadaan kecemasan diabetis, termasuk pasukan kecemasan, kerana peranti ini bukan sahaja boleh dipercayai, tetapi mereka juga menghasilkan hasil yang cepat. "

Sebagai kesimpulan, kita harus menyebutkan kelemahan kaedah glukosa oksidase. Yang terhasil hidrogen peroksida dan anion radikal superoksida bukan sahaja boleh mengoksidakan chromogen, tetapi bahan-bahan lain di dalam cecair biologi: asid askorbik, asid urik, bilirubin. Dalam kes ini, dengan itu, bahagian peroksida, mengambil bahagian dalam pengoksidaan chromogen yang dikurangkan, yang membawa kepada memandang rendah keputusan glukosa. Kaedah ini linear, sebagai peraturan, sehingga 20-30 mmol / l glukosa.

Kaedah Hexokinase

Pendaftaran dilakukan pada panjang gelombang 340 nm pada penyerapan NADH. Kaedah ini sangat spesifik dan tidak bertindak balas dengan komponen lain serum darah. Kaedah hexokinase dianggap rujukan untuk penentuan glukosa. Sebagai peraturan, ia adalah linear kepada 50 mmol / l, yang membenarkan ia disyorkan secara meluas untuk klinik dengan jabatan endokrinologi.

Daripada pelbagai kaedah yang diterangkan untuk penentuan glukosa, pekerja QDL boleh menentukan sendiri kaedah penentuan dan peranti mana yang hendak dipilih:

  • Kaedah biokimia "basah", yang dilaksanakan pada penganalisis biokimia automatik, akan menyediakan keperluan makmal dengan aliran analisis yang besar.
  • Penganalisis glukosa jenis biokimia memerlukan usaha yang minimum dari pengendali, kerana ia adalah sepenuhnya automatik dan cukup produktif (kelajuan 50 hingga 200 sampel sejam).
  • Bagi makmal dengan sejumlah kecil kajian, serta makmal nyata, sebuah fotometer biokimia khusus Mikrolab 540 adalah mudah.
  • Bagi pasukan bantuan, menyembunyikan bantuan adalah penyelesaian sempurna - meter glukosa darah seperti One Touch.

Oleh itu, tugas QDL untuk memastikan bukan sahaja cepat, tetapi juga penentuan glukosa yang sangat tepat, dapat diselesaikan sepenuhnya hari ini.

Glukosa darah, air kencing, minuman keras

Glukosa darah dikawal ketat.

Kawalan kepekatan glukosa dalam darah dilakukan oleh pengaruh saraf dan hormon.

Peraturan saraf

Peraturan konsentrasi glukosa saraf dalam darah dinyatakan dalam efek positif n.vagus pada rembesan insulin dan efek penghambatan pada proses pemeliharaan simpatik ini. Di samping itu, pelepasan adrenalin ke dalam darah adalah tertakluk kepada pengaruh simpatik.

Peraturan hormon

Faktor utama hormon utama ialah glukagon, adrenalin, glucocorticoid, hormon somatotropik di satu pihak, dan insulin pada yang lain. Semua hormon, kecuali insulin, menjejaskan hati, meningkatkan glukemia.

Insulin adalah satu-satunya hormon dalam badan yang bertujuan menurunkan kadar glukosa darah. Dengan pengaruhnya, glukosa sangat diserap oleh otot dan tisu adipose.

Penurunan kepekatan glukosa darah oleh insulin dicapai dengan cara berikut:

  • peralihan glukosa ke dalam sel - pengaktifan protein transporter GluT 4 pada membran sitoplasma,
  • penglibatan glukosa dalam glikolisis - peningkatan dalam sintesis glukokinase, enzim yang dipanggil perangkap glukosa, rangsangan sintesis enzim glikolisis utama lain - phosphofructokranase, pyruvate kinase,
  • peningkatan sintesis glikogen - pengaktifan sintetik glikogen dan rangsangan sintesisnya, yang memudahkan penukaran glukosa berlebihan menjadi glikogen,
  • pengaktifan laluan pentos fosfat - induksi sintesis glukosa-6-fosfat dehidrogenase dan 6-phosphogluconate dehydrogenase,
  • peningkatan lipogenesis - penglibatan glukosa dalam sintesis triacylglercerols atau phospholipid.

Banyak tisu sepenuhnya tidak sensitif kepada tindakan insulin, mereka dipanggil insulin-independent. Ini termasuk tisu saraf, badan vitreous, kanta, retina, sel-sel buah pinggang glomerular, sel endothelial, buah zakar, dan sel-sel darah merah.

Glukagon menimbulkan glukosa darah:

  • meningkatkan penggerak glikogen melalui pengaktifan fosforilasi glikogen,
  • merangsang glukoneogenesis - meningkatkan kerja enzim pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, fructose-1,6-diphosphatase.

Adrenalin menyebabkan hiperglikemia:

  • mengaktifkan penggerak glikogen - rangsangan phosphorylase glikogen,

Glukokortikoid meningkatkan glukosa darah

  • dengan menekan peralihan glukosa ke dalam sel,
  • merangsang glukoneogenesis - meningkatkan sintesis enzim pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, fruktosa-1,6-diphosphatase.

Jadual merangkum aspek utama pengaruh hormon:

  • Pengaktifan glikogenolisis dalam hati;
  • Stimulasi glukoneogenesis;
  • Peningkatan glukoneogenesis;
  • Mengurangkan kebolehtelapan membran ke glukosa.

Glukosa darah dalam amalan klinikal

Lebih 90% daripada semua karbohidrat darah berat molekul rendah yang terlarut adalah glukosa; Di samping itu, fruktosa, maltosa, mannose dan pentosa mungkin terdapat dalam jumlah yang kecil, dan dalam kes patologi, galaktosa. Bersama mereka dalam darah mengandungi polisakarida yang berkaitan dengan protein.

Glukosa secara intensif digunakan dan digunakan untuk pelbagai keperluan tisu sistem saraf pusat, sel darah merah, medulla buah pinggang. Dalam metabolisme pertengahan, glukosa digunakan untuk membentuk glikogen, gliserol dan asid lemak, asid amino, asid glucuronic dan glikoprotein. Kepekatan glukosa dalam darah adalah derivatif glikolisis dan pengoksidaan asid trikarboksilat dalam kitaran TCA, glikogenesis dan glikogenolisis dalam tisu hati dan otot, glukoneogenesis dalam hati dan buah pinggang, dan pengambilan glukosa dari usus.

Dalam amalan klinikal, tahap glukosa darah biasanya diperiksa, kepekatan gula dan glikogen lain digunakan kurang kerap. Dalam darah manusia, glukosa secara adilnya diedarkan di antara plasma dan unsur-unsur yang membentuk, kandungan gula dalam darah vena adalah 0.25-1.0 mmol / l (purata 10%) kurang daripada darah arteri dan kapilari. Takrifan asid laktik dan piruvat, aktiviti enzim metabolisme karbohidrat, asid sialik dan heksuronik, seromukoid, hemoglobin glikosilat, dan petunjuk lain adalah nilai diagnostik yang diketahui.

Kandungan glukosa dalam air kencing bergantung kepada kepekatannya dalam darah, walaupun dikumuhkan dalam kedua-dua tahap gula darah normal dan tinggi. Dengan peningkatan kepekatan glukosa dalam darah, ambang ginjal yang dipanggil (di kalangan orang yang sihat itu terletak di kawasan 8.3-9.9 mmol / l) dan glukosuria berlaku. Dengan buah pinggang arteriosklerotik, dengan kencing manis, peningkatan ambang dan glukosuria tidak dapat diperhatikan walaupun dengan peningkatan kepekatan glukosa hingga 11.0-12.1 mmol / l.

Kaedah untuk penentuan glukosa darah

Kaedah untuk penentuan glukosa darah dibahagikan kepada tiga kumpulan: pengurangan, kolimetrik dan enzim.

  1. Kaedah pengurangan (Perlu diingat bahawa kaedah kumpulan ini memberikan hasil yang terlalu besar (kira-kira 20-25%), kerana darah mengandungi beberapa sebatian yang tidak berkaitan dengan karbohidrat, tetapi dengan mengurangkan sifat (asid urik, glutation, kreatinin, askorbik asid)):
    • Kaedah titrometrik Hagedorn-Jensen adalah berdasarkan kepada sifat gula untuk memulihkan, apabila mendidih dalam garam kalium, besi dan sinus dan garam-garam kalium besi. Mengikut tahap pemulihan ini, kepekatan gula dalam darah diselidiki oleh titrometri. Kelebihan penting kaedah ini ialah kos yang rendah dan kemungkinan penggunaan di mana-mana makmal;
    • berdasarkan pengurangan nitrobenzenes, sebagai contoh, asid picric kepada asid picramic;
    • kaedah berdasarkan keupayaan glukosa untuk mengurangkan garam tembaga. Tembaga monovalen bertindak sebagai perantaraan. Dioksidakan oleh oksigen udara, ia memulihkan asid arsenik-molybdic atau asid fosfatotungstik, yang berfungsi sebagai kromogen akhir.
  2. Kaedah colorimetric. Ini termasuk:
    • Kaedah Somodzhi - tindak balas pengurangan tembaga, yang berada dalam komposisi reagen tembaga-ortron, kepada cuprous oksida. Kaedah ini susah payah, multi-dipentaskan, tidak spesifik dan hampir tidak digunakan pada masa kini;
    • Kaedah Folin-Wu - pengurangan tembaga tartrate kepada litium oksida. Kaedah ini mudah, kelemahan adalah kekurangan ketetapan yang ketat antara intensiti warna yang diperoleh dan kepekatan glukosa;
    • penentuan kepekatan glukosa menurut Morris dan Roe - dehidrasi glukosa di bawah tindakan asid sulfurik dan transformasinya menjadi oxymethylfurfural, yang menggabungkan dengan arthron menjadi sebatian biru. Memerlukan reagen tulen dan pematuhan ketat terhadap suhu tindak balas berterusan;
    • Kaedah orthotoluidine Gultman dalam pengubahsuaian Khivarinen-Nikkil, yang terdiri daripada menentukan keamatan penyelesaian pewarnaan yang berlaku apabila amina orthotoluidine berinteraksi dengan kumpulan aldehid glukosa dalam medium berasid. Kaedah ini adalah tepat dan membolehkan penentuan glukosa yang lebih spesifik.
    • Kaedah aniline, mengekalkan kepekaan kaedah orthotoluidine, tetapi lebih spesifik.
  3. Kaedah enzimatik:
    • berdasarkan tindak balas heksokinase. Glukosa di bawah tindakan hexokinase di fosforilasi oleh ATP, Gl-6-F yang terhasil dengan kehadiran dehydrogenase mengembalikan NADP. Jumlah yang ditentukan ditentukan oleh peningkatan penyerapan cahaya di rantau ultraviolet. Kaedah ini terlalu mahal untuk makmal praktikal.
    • berdasarkan pengoksidaan glukosa kepada asid glucuronic menggunakan enzim glukosa oksidase dan pembentukan semasa tindak balas hidrogen peroksida, yang (dalam versi berbeza):
      • ditentukan oleh cara kimia;
      • dengan penyerapan peroksidase, ia mengoksidakan orthotolidine tidak berwarna, menjadikan ia menjadi sebatian berwarna hijau-hijau, kelurusan pergantungan warna pada kepekatan glukosa kekal dalam lingkungan antara 1.1 hingga 22 mmol / l;
      • dengan kehadiran fenol dengan penyertaan peroksidase, mengoksidasi 4 - aminoantipyrine ke dalam sebatian berwarna merah jambu berwarna;
      • dengan kehadiran ion tembaga, ia mengoksidasi phenolphthalin kepada phenolphthalein, yang berwarna merah di bawah keadaan alkali.
  4. Kaedah elektrokimia yang menggunakan elektrod yang mengandungi enzim immobilized, khususnya, glukosa oksidase. Reaksi direkodkan oleh jumlah hidrogen peroksida yang terbentuk atau oleh kehilangan oksigen yang digunakan untuk pengoksidaan glukosa.
  5. Jalur diagnostik menggunakan reaksi glukosa oksidase-peroksidase dan derivatif benzidin sebagai kromogen.

Tiga kaedah digunakan sebagai bersatu: kaedah titrometrik Haggedorn-Jensen, kaedah orto-toluidin dan kaedah oksidase glukosa o-tolidin.

Penentuan glukosa oleh kaedah orthotoluidine

Prinsip

Glukosa apabila dipanaskan dengan orthotolude dengan kehadiran asid sulfurik memberikan warna biru-hijau.

Penentuan glukosa dengan kaedah glukosa oksidase

Menentukan kepekatan glukosa dalam darah adalah salah satu kajian biokimia yang paling kerap dilakukan di makmal.

Kaedah glukosa oksidase untuk menentukan glukosa dalam darah dan air kencing adalah berdasarkan tindak balas pengoksidaan glukosa di hadapan enzim glukosa oksidase untuk membentuk hidrogen peroksida, yang seterusnya dengan kehadiran peroksidase mengoksidakan orthotoluidine untuk membentuk produk berwarna; Kepekatan glukosa dinilai oleh bilangan produk yang berwarna.

Oleh kerana kaedah glukosa oksidase bertujuan mengenal pasti glukosa, dan bukan semua jenis gula, ia digunakan dalam diagnosis pembezaan penyakit berikut:

Prinsip

Glukosa di hadapan enzim glukosa oksidase dioksidakan oleh oksigen atmosfera untuk membentuk hidrogen peroksida semasa reaksi. Hidrogen peroksida di hadapan enzim peroksidase mengoksidakan orthotoluidine untuk membentuk sebatian berwarna, keamatan warna yang berkadar dengan kandungan glukosa.

Kaedah glukosa oksidase membolehkan menentukan tahap glukosa dalam plasma darah, cecair serum dan cerebrospinal.

Norm mmol / l

- dalam plasma, dalam natsheartse

  • bayi baru lahir - 1.7 - 4.2
  • kanak-kanak dari 6 minggu hingga 15 tahun - 3.3 - 5.4
  • dewasa (lelaki, wanita) - 3.8 - 5.5

- dalam serum, dalam natsheartse

  • bayi baru lahir - 2.6 - 4.2
  • kanak-kanak dari 6 minggu hingga 2 tahun - 3.3 - 5.4
  • dewasa (lelaki, wanita) - 3.8 - 5.5

Reagen

1. Natrium klorida 9 gram / liter (larutan isotonik): disiapkan dengan melarutkan 0.9 g NaCl dalam 100 ml air.

2. Zink sulfat, 50 g / l: 5 g zink sulfat (ZnSO4) dibubarkan dalam air, jumlahnya dibawa kepada 100 ml.

3. Natrium hidroksida, 0.3 mol / l: disediakan dengan melarutkan 1.2 g NaOH dalam 100 ml air, kepekatan diperiksa oleh titrasi (ia mestilah 0.3 n).

4. Orthotoluidine, penyelesaian 1%: 1 g ubat dibubarkan dalam 100 ml alkohol mutlak. Penyelesaiannya boleh disimpan di dalam peti sejuk di dalam kuah dengan penyumbat kaca selama beberapa bulan. Produk yang boleh dijual secara komersil boleh disucikan dengan penghabluran semula, yang mana ia dibubarkan dalam alkohol mutlak, air ditambah dan kristal yang dihidupkan disedut pada penuras, kemudian dikeringkan di atas kalsium klorida.

5. Larutan pengacuan asetat pH 4.8: campurkan 4 bahagian 0.25 n asid asetik (cek oleh titrasi) dan 6 bahagian 0.25 n natrium asetat (mengandungi 34 g CH3COONa X ZN2O dalam 1 liter).

6. Glukosa oksidase adalah penyediaan kering dengan aktiviti 3000 unit / mg atau lebih.

7. Peroksidase teruk. 1 mg dibubarkan dalam 5 ml buffer acetate, ia boleh disimpan di dalam peti sejuk selama beberapa hari.

8. Reagen kerja: larutkan 2 mg glukosa oksidase dan 1 mg peroksidase dalam 80 ml penahan asetik, tambah 1 ml 1% larutan orthotoluidine, campuran dan masukkan isipadu kepada 100 ml dengan larutan penampan. Reagen kerja mestilah telus, tidak berwarna atau mempunyai kelabu hijau yang lemah, yang mana ia stabil apabila disimpan dalam keadaan sejuk. Sekiranya warna itu sengit atau selepas beberapa jam selepas penyediaan, satu precipitate mula jatuh, ini bermakna orthotoluidine tidak cukup murni dan perlu direkristalisasi.

9. Penyelesaian glukosa penentukuran. Glukosa pra-kering pada suhu 37 ° C dan disimpan dalam desiccator. Pertama, sediakan penyelesaian asas dengan kepekatan 50 mmol / l, yang 180 mg bahan dibubarkan dalam 20 ml larutan tepu (kira-kira 0.3%) asid benzoik. Dari penyelesaian ini, sediakan penyelesaian penentukuran kerja yang mengandungi 3; 6; 9; 12; 15; 18 dan 21 mmol / l, yang mana mereka mengambil 0.6; 1.2; 1.8; 2.4; 3; 3.6 dan 4.2 ml penyelesaian asas dan membawa larutan asid benzoik tepu kepada jisim 10 ml. Penyelesaian ini mengandungi glukosa dalam kepekatan yang sama kerana ia berlaku dalam darah, yang memudahkan pengiraan semasa penentukuran.

Kursus penentuan

Di dalam tiub sentrifug menambah 1.1 ml larutan natrium klorida, 0.4 ml larutan zink sulfat dan 0,4 ml larutan 0.3 n NaOH, campuran; pada masa yang sama, gel zink hidroksida yang sangat tipis terbentuk, 0.1 ml penyelesaian darah atau penentukuran dilepaskan ke dalamnya, dicampur semula dan disentri selepas 10 minit pada kelajuan 3000 rpm selama 10 minit.

Untuk 1 ml supernatan menambah 3 ml reagen bekerja dan campuran dengan perlahan.

Warna secara beransur-ansur mula berkembang, yang pada suhu bilik normal mencapai maksimum dalam 13-15 minit, dan kemudian secara beransur-ansur berkurang. Secara fotometrik selalu selepas tempoh masa yang sama selepas menambahkan reagen kerja dalam cuvettes dengan panjang jalur optik 1 sentimeter dengan penapis cahaya merah (panjang gelombang 625 nm) berbanding pengalaman terbiar, yang disusun serentak dengan sampel kerja, tetapi bukan darah, mengambil larutan natrium klorida fisiologi.

Apabila menyediakan graf penentukuran, 0.1 ml penyelesaian penentukuran yang sesuai diambil daripada sampel darah.

Pengiraan glukosa boleh dijalankan mengikut peraturan perkadaran atau jadual penentukuran, untuk membina kepekatan glukosa (mmol / l) diletakkan pada satu paksi, dan nilai kepupusan adalah pada yang lain.

Nota

1. Anda boleh melepaskan darah dari pipet ke dalam larutan isotonik natrium klorida, kemudian menambah larutan zink sulfat dan NaOH.

2. Dengan kerja sistematik, tidak perlu sentiasa membuat jadual penentukuran untuk semua mata, mencukupi untuk memproses sampel kosong dan 2-3 mata dalam julat 3-9 mmol / l setiap hari, dan membina jadual penentukuran penuh hanya apabila menukar reagen atau menyesuaikan prosedur.